ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激

要約

本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。

要約

胚形成中、協調的な細胞運動は、遺伝子発現および活性を調節する機械的な力を生成する。このプロセスを研究するために、吸引やカバーガラス圧縮などのツールを使用して、胚全体を機械的に刺激してきました。これらのアプローチは、不正確であり、手動処理を必要とし、同時に数個の胚しか処理できないため、実験計画を制限します。マイクロ流体システムは、スループットと精度を向上させながら、このような実験タスクを自動化する大きな可能性を秘めています。この記事では、ショウジョウバエ メラノガスター(ショウジョウバエ )胚全体を正確に圧縮するために開発されたマイクロ流体システムについて説明します。このシステムは、空気圧で作動する変形可能な側壁を備えたマイクロチャネルを備えており、胚の整列、固定化、圧縮、および刺激後の収集を可能にします。これらのマイクロチャネルを7つのレーンに並列化することにより、安定したまたは動的な圧縮パターンを数百の ショウジョウバエ 胚に同時に適用できます。このシステムをガラスカバーガラス上に製造することで、高解像度顕微鏡によるサンプルの機械的刺激とイメージングを同時に行うことができます。さらに、PDMSのような生体適合性材料の利用と、システム内を流体を流す能力により、このデバイスは媒体依存サンプルを用いた長期実験が可能です。このアプローチにより、サンプルに機械的にストレスを与える手動取り付けの必要性もなくなります。さらに、マイクロチャネルからサンプルを迅速に収集できるため、従来の機械的刺激アプローチでは達成できない大量のサンプルを必要とするオミクスアッセイを含む、刺激後の分析が可能になります。このシステムの形状は、異なる生物学的システムに対して容易に拡張可能であり、多数の分野が、高いサンプルスループット、機械的刺激または固定化、および自動アライメントを含む本明細書に記載される機能的特徴から利益を得ることを可能にする。

概要

生命システムは、その生涯を通じて常にさまざまな機械的入力を経験し、応答します¹。メカノトランスダクションは、発達障害、筋肉や骨の喪失、機械的環境によって直接的または間接的に影響を受けるシグナル伝達経路を介した神経病理学など、多くの疾患に関連しています²。しかし、機械受容性シグナル伝達経路⁴における機械的刺激³によって制御される遺伝子やタンパク質はほとんど分かっておらず⁵、機械的制御機構の解明や病的メカノトランスダクションに関連する疾患の分子標的の同定は進んでいません^6,7。.メカノバイオロジー研究を関連する生理学的プロセスに投影する際の制限要因の1つは、無傷の多細胞生物の代わりに、従来の培養皿で個々の細胞を使用することです。ショウジョウバエ(ショウジョウバエ)などのモデル生物は、動物の発生に関与する遺伝子、シグナル伝達経路、およびタンパク質の理解に大きく貢献しています^8,9,10。しかし、ショウジョウバエなどの多細胞モデル生物をメカノバイオロジー研究に利用することは、実験ツールの課題によって妨げられてきました。様々な刺激を準備、ソート、イメージング、または適用するための従来の技術は、ほとんどが手動操作を必要とする。これらのアプローチは時間がかかり、専門知識を必要とし、ばらつきをもたらし、実験計画とサンプルサイズを制限します¹¹。最近のマイクロテクノロジーの進歩は、非常に高いスループットと高度に制御された実験パラメータを備えた新しい生物学的アッセイを可能にするための優れたリソースです^12、13、14。

本稿では、ショ ウジョウバエ の数百個の胚全体に一軸圧縮の形で機械的刺激を整列させ、固定し、正確に適用するための強化されたマイクロ流体デバイスの開発について説明します¹⁵(図1)。マイクロ流体システムとガラスカバーガラスの統合により、刺激中のサンプルの高解像度共焦点イメージングが可能になりました。また、マイクロ流体デバイスは、オミクスアッセイを実行するための刺激後の胚の迅速な収集を可能にしました(図2)。このデバイスの設計上の考慮事項の説明、ならびにソフトリソグラフィおよび実験的特性評価を使用した製造を本明細書に記載する。このようなデバイスのシリコンウェーハモールドを製造するには、高アスペクト比(AR)トレンチ(AR >5)を備えた大面積にわたって厚いフォトレジスト(厚さ>200μm)を均一にコーティングする必要があるため、この方法は従来のフォトリソグラフィモールド製造プロトコルを大幅に変更しました。このようにして、この方法は、フォトレジストの取り扱い、接着、コーティング、パターニング、および現像を容易にした。さらに、潜在的な落とし穴とその解決策についても説明します。最後に、この設計および製造戦略の多様性は、 ショウジョウバエ 卵室や脳オルガノイドなどの他の多細胞システムを使用して実証されました¹⁶。

プロトコル

1. シリコンウェーハモールドの準備

1. シリコンウェーハ( 材料表を参照)を最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコール(IPA)で洗浄します。
2. シリコンウェーハを250°Cのホットプレートに30分間置き、脱水ベークを行います(図3A)。
3. シリコンウェーハをベーパープライムオーブン( 材料表を参照)でヘキサメチルジシラザン(HDMS)でコーティングします(プロセス温度:150°C、プロセス圧力:2 Torr、プロセス時間:5分、HDMS容量:5 μL)(図3B)。
4. SU-8 2100フォトレジストのボトル( 材料の表を参照)を60°Cのオーブンに15分間入れて、粘度を下げます。
   注:オーブンで加熱すると、フォトレジストの粘度が低下します。粘度の低いフォトレジストは、より簡単に取り扱うことができ、ウェーハの上により正確に注ぐことができます。
5. シリコンウェーハを60°Cのホットプレートに置き、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、ウェーハの各インチに1 mLの加熱フォトレジストを注ぎます(図3C)。
6. フォトレジスト塗布シリコンウェーハをスピンコーターに移します( 材料表を参照)。
7. 最初に250 rpmで30秒間、次に350 rpmでさらに30秒間、どちらも100 rpm / sの加速でプリスピンを適用します(図3D)。
8. クリーンルームスワブを使用して、シリコンウェーハの端から余分なフォトレジストを取り除きます。
9. 最初に500 rpmで100 rpm / sの加速度で15秒間スピンを適用し、次に1450 rpmで30 rpm / sの加速度で30秒間スピンを適用します(図3E)。
10. クリーンルームの綿棒でエッジビードを取り外します。
11. シリコンウェーハを50°Cのホットプレートに置き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します(図3F)。
12. ホットプレートの温度を2°C / minの速度で95°Cまでゆっくりと上昇させます。
13. シリコンウェーハを95°Cで50分間ソフトベークします(図3G)。
14. ホットプレートを2°C / minの速度で室温までゆっくりと冷却します。
15. シリコンウェーハをマスクアライナー( 材料表を参照)に置き、その上にフォトマスクを配置します(フォトマスクの形状については 補足図1 を参照してください)。
16. コンタクトマスクアライナーを使用して、フォトマスクを通してシリコンウェーハを350 mJ / cm 2のUV光(35 mW / cm²で10秒間)にさらします(図3H)。
17. ウェーハを50°Cのホットプレートに5分間、65°Cでさらに5分間、最後に80°Cでさらに20分間、シリコンウェーハに連続した露光後ベークを適用します(図3I)。
18. シリコンウェーハを2°C/分の速度で室温までゆっくりと冷却します。
19. シリコンウェーハより少し小さい直径のマグネチックスターラーをビーカーに入れます。シリコンウェーハを逆さまにして、ビーカーの上に置きます。
20. ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます( 材料の表を参照)。シリコンウェーハを現像液に30分間沈めたまま、スターラーをオンにしておきます(図3J)。
21. シリコンウェーハを、40kHzで1時間、新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理器に移します(図3K)。
22. シリコンウェーハをIPA溶液で徹底的に洗浄して、最終的なシリコンウェーハモールドを取得します(図3L)。

2. マイクロ流体チップの作製

1. シリコンウェーハモールドを10滴(~500 μL)のトリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン(PFOCTS、 材料表を参照)と一緒にデシケーターに入れ、近くの小さな計量ボートに入れます。
2. デシケーターを真空ポンプに約200Torrで30分間接続します。
3. デシケーターバルブをオフにし、PFOCTSコーティングのために真空ポンプを一晩外します。
4. PDMSベースと硬化剤( 材料の表を参照)を10:1の比率で混合することにより、硬化前のポリジメチルシロキサン(PDMS)溶液を調製します。
5. 混合物を遠心分離機(室温で5分間500 x g )に入れて脱気します。
   注意: この遠心分離により、気泡が上面に移動し、その結果、短時間で除去されます。
6. 脱気したPDMS溶液をシリコンウェーハモールドに注ぎます。
7. 再度脱気して、金型表面に閉じ込められた気泡を取り除きます。
8. PDMSを60°Cのオーブンで1時間50分間硬化させます(図3M)。
9. メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します(図3N)。
10. PDMSパーツをはがし、カッティングマットの上に逆さまに置きます。
11. かみそりを使用して、PDMS部品を最終的な形状にカットします(図3O)。
12. 生検パンチ( 材料表を参照)または先端が鈍い針(図3P)を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。
    1. 胚入口穴には、直径4mmのパンチを使用します。
    2. 胚出口の穴には、直径1.3 mmのパンチを使用します。
    3. ガス入口穴には、2mmパンチを使用します。
13. スコッチテープを使用して、PDMSのパターン化された表面に残っている可能性のある粒子を取り除きます。
14. 24 mm x 60 mmの長方形のスライドガラスを最初にアセトンで洗浄し、次にIPAで洗浄します。
15. ろ過された空気源に接続されたエアガンでガラス表面を乾燥させます。
16. スライドガラスを250°Cのホットプレートに2時間置き、脱水ベークを適用します(図3Q)。
17. 表面の汚染を防ぐために、スライドガラスをビーカーで覆います。
18. パターン化された面を上にしてPDMSを配置し、脱水ガラスをプラズマクリーナーにスライドさせます(材料の表を参照)。
19. PDMSとスライドガラスを酸素プラズマで18 Wで30秒間処理します。
20. PDMSをスライドガラス上に置き、パターン化された表面をスライドガラスに向けて、共有結合 を介して マイクロチャネルをシールします(図3R)。
21. ピンセットを使用してPDMS部品をスライドガラスにそっと押し付け、完全なコンフォメーション接触を確保します。
22. 完成したマイクロ流体チップを室温で一晩保管し、ボンディングが最終的な強度に達するようにします。

3.ショウジョウバエ胚の調製

1. オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレート(1.5%寒天、25%リンゴジュース、2.5%スクロース)に卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の所望の発育時間にプレートを集める。
   注:本実験では、プレートを140分で収集し、細胞化段階¹⁷で胚を調製および選別しました。
2. 寒天に胚卵洗浄液(0.12 M NaCl、0.04% Triton-X 100)を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。
3. 胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌します。組織ふるいを通して胚をこすり、水で漂白剤溶液を完全に洗い流します。
4. 胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄を入れた90mmガラスのペトリ皿に胚を移します。
5. 解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。
   注:このアプリケーションでは、細胞化段階の胚が選択されました。適切な発達段階の選択を確実にする方法の詳細な説明は、 ショウジョウバエ¹⁷の実験室ハンドブックに記載されています。

4. マイクロ流体チップを用いたショウジョウバエ胚への機械的刺激の適用

1. 7つの胚マイクロチャネルすべてを、メイン胚導入ポートから0.4 μmのフィルターIPAで充填してプライミングします。
2. IPAを0.4μmのろ過された脱イオン(DI)水と交換します。
3. DI水を胚卵洗浄液に置き換えます。
4. ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。
5. 胚を胚導入ポートにピペットで入れます(図4A)。
6. ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSIの負圧(つまり、真空)を適用し、胚のマイクロチャネルを開きます。
7. マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列し、胚のマイクロチャネルに定着するようにします(図4B)。
8. 同時に入る複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから再び下に傾けて詰まりを取り除きます。
9. 必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。
10. 胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。
11. マイクロ流体チップを水平位置に戻します(図4C)。
12. 圧力計付きのポータブル陽圧源( 材料表を参照)をガス入口に接続して、3PSI圧縮を適用します(図4D)。
13. 圧力計を継続的にチェックして、一貫した圧縮レベルが適用されていることを確認します。
14. 機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。
15. 圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、ガス入口に真空を適用して胚を解放します。
16. 次に、マイクロ流体チップを上方に傾けて、胚が胚導入口に向かって移動する(図4E)。
17. ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。
    注:収集時に、ショウジョウバエを成虫に成長させることによって、胚発生と生存能力に対する圧迫の影響を調査できます。マイクロ流体デバイスのハイスループット処理能力により、多数のサンプルを必要とするダウンストリームオミクスベースのアッセイで胚を使用することもできます(図2)。

結果

マイクロ流体システムは、変形可能なPDMS側壁によって分離された2つのサブコンパートメントに分割されています。最初のコンパートメントは、 ショウジョウバエ の胚が導入され、自動的に整列され、整列され、圧縮される液体システムです。2番目のコンパートメントは、圧縮チャネルの有効幅を正確に制御するために、圧縮チャネルの両側のガス圧力が行き止まりのマイクロチャ?...

ディスカッション

この記事では、何百もの ショウジョウバエ 胚全体に機械的刺激を自動的に整列させ、固定し、正確に適用するマイクロ流体デバイスの開発について説明しています。マイクロ流体システムと薄いガラスカバーガラスの統合により、刺激中に高解像度の共焦点顕微鏡で胚をイメージングすることができました。マイクロ流体デバイスは、下流の生物学的アッセイを実行するための刺激?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes	Fisher	14-955-111B	Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer	University Wafer	452
Biopsy punches	Ted Pella	15110
Bleach			Not brand specific
Blunt needle set	CML Supply	901
Contact Mask Aligner	Quintel	Q4000 MA
Cutting mat	Dahle	Vantage 10670	size: 24" x 36"
Developer	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
Direct Write Lithographer	Heidelberg	MLA100
Dissecting microscope			Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem	SU-8 2100
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Portable pressure source	hygger Quietest	HGD946
Pressure gauge	Cole-Parmer	EW-68950-25
Spin Coater	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05
Vacuum Pump	Cole-Parmer	EW-07164-87