Un protocolo de limpieza eficiente para el estudio del desarrollo de semillas en tomate (Solanum lycopersicum L.)

Resumen

La semilla de tomate es un modelo importante para estudiar la genética y la biología del desarrollo durante la reproducción de las plantas. Este protocolo es útil para limpiar las semillas de tomate en diferentes etapas de desarrollo para observar la estructura embrionaria más fina.

Resumen

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es uno de los principales cultivos comerciales en todo el mundo. La semilla de tomate es un modelo importante para estudiar la genética y la biología del desarrollo durante la reproducción de las plantas. La visualización de la estructura embrionaria más fina dentro de una semilla de tomate a menudo se ve obstaculizada por el mucílago de la capa de semillas, el tegumento de capas múltiples y un endospermo de paredes gruesas, que debe resolverse mediante una laboriosa sección de incrustación. Una alternativa más simple es emplear técnicas de limpieza de tejidos que hacen que la semilla sea casi transparente utilizando agentes químicos. Aunque los procedimientos convencionales de limpieza permiten una visión profunda de las semillas más pequeñas con una capa de semilla más delgada, la limpieza de las semillas de tomate sigue siendo un desafío técnico, especialmente en las últimas etapas de desarrollo.

Aquí se presenta un protocolo de limpieza rápido y que ahorra mano de obra para observar el desarrollo de las semillas de tomate de 3 a 23 días después de la floración, cuando la morfología embrionaria está casi completa. Este método combina la solución de limpieza a base de hidrato de cloral ampliamente utilizada en Arabidopsis con otras modificaciones, incluida la omisión de la fijación de formalina-aceto-alcohol (FAA), la adición del tratamiento con hipoclorito de sodio de las semillas, la eliminación del mucílago de la cubierta de semilla ablandada y el lavado y el tratamiento al vacío. Este método se puede aplicar para la limpieza eficiente de semillas de tomate en diferentes etapas de desarrollo y es útil en el monitoreo completo del proceso de desarrollo de semillas mutantes con buena resolución espacial. Este protocolo de limpieza también se puede aplicar a imágenes profundas de otras especies comercialmente importantes en las solanáceas.

Introducción

El tomate (S. lycopersicum L.) es uno de los cultivos hortícolas más importantes del mundo, con una producción de 186,8 millones de toneladas de frutos carnosos de 5,1 millones de hectáreas en 2020¹. Pertenece a la gran familia Solanaceae con alrededor de 2.716 especies², incluyendo muchos cultivos comercialmente importantes como berenjenas, pimientos, patatas y tabaco. El tomate cultivado es una especie diploide (2n = 2x = 24) con un tamaño de genoma de aproximadamente 900 Mb³. Durante mucho tiempo, se ha hecho un gran esfuerzo hacia la domesticación y reproducción del tomate mediante la selección de rasgos deseables de Solanum spp. silvestres. Hay más de 5.000 accesiones de tomate listadas en el Centro de Recursos Genéticos del Tomate y más de 80.000 germoplasma de tomates se almacenan en todo el mundo⁴. La planta de tomate es perenne en el invernadero y se propaga por semillas. Una semilla de tomate madura consta de tres compartimentos principales: un embrión adulto, endospermo residual de tipo celular y una capa dura de semilla ^5,6 (Figura 1A). Después de la doble fertilización, el desarrollo del endospermo de tipo celular precede al desarrollo de cigotos. A ~ 5-6 días después de la floración (DAF), el proembrión bicelular se observa por primera vez cuando el endospermo consta de seis a ocho núcleos⁷. En Solanum pimpinellifolium, el embrión se acerca a su tamaño final después de 20 DAF, y las semillas son viables para la germinación después de 32 DAF⁸. A medida que el embrión se desarrolla, el endospermo se absorbe gradualmente y solo queda una pequeña cantidad de endospermo en la semilla. El endospermo residual consiste en endospermo micropilar que rodea la punta de la radícula, y endospermo lateral en el resto de la semilla ^9,10. La capa externa de la semilla se desarrolla a partir de la epidermis externa engrosada y lignificada del tegumento, y con las capas muertas de restos de tegumento, forman una cáscara dura para proteger el embrión y el endospermo⁵.

Figura 1: Representación esquemática de una semilla madura en Solanum lycopersicum y Arabidopsis thaliana. (A) Anatomía longitudinal de una semilla de tomate maduro. (B) Anatomía longitudinal de una semilla madura de Arabidopsis. Una semilla de tomate maduro es aproximadamente 70 veces más grande en tamaño que una semilla de Arabidopsis. Barras de escala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La producción de semillas de tomate de alta calidad depende de la coordinación entre el embrión, el endospermo y los componentes de la semilla materna¹¹. La disección de genes y redes clave en el desarrollo de semillas requiere un registro fenotípico profundo y completo de semillas mutantes. Las técnicas convencionales de embutido-seccionamiento, como la sección semifina y la sección de parafina, se aplican ampliamente a las semillas de tomate para observar las estructuras locales y más finas del embrión^12,13,14,15. Sin embargo, analizar el desarrollo de la semilla a partir de secciones delgadas suele ser laborioso y carece de resolución espacial del eje z. En comparación, la limpieza del tejido es un método rápido y eficiente para identificar la etapa de desarrollo de los defectos embrionarios que tienen más probabilidades de ocurrir¹⁶. El método de depuración reduce la opacidad del tejido interno homogeneizando el índice de refracción con uno o más agentes bioquímicos¹⁶. El aclaramiento de tejido completo permite observar la estructura de un tejido vegetal sin destruir su integridad, y la combinación de la tecnología de limpieza y la imagen tridimensional se ha convertido en una solución ideal para obtener información sobre la morfología y el estado de desarrollo de un órgano vegetal^17,18. A lo largo de los años, las técnicas de limpieza de semillas se han utilizado en varias especies de plantas, incluyendo Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare y Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Entre estos, la tecnología de limpieza de óvulos de montaje completo ha sido un enfoque eficiente para estudiar el desarrollo de semillas de Arabidopsis, debido a su pequeño tamaño, 4-5 capas de la célula de recubrimiento de la semilla y el endospermo de tipo nuclear^24,25. Con la actualización continua de diferentes mezclas de aclaramiento, como la aparición de la solución de Hoyer²⁶, las estructuras internas del óvulo de cebada fueron fotografiadas con un alto grado de claridad, aunque su endospermo constituye la mayor parte de las semillas. La embriogénesis de la remolacha azucarera se puede observar mediante la limpieza combinada con el tratamiento al vacío y el ablandamiento con ácido clorhídrico¹⁹. Sin embargo, a diferencia de las especies mencionadas anteriormente, no se han reportado observaciones embriológicas mediante protocolos de limpieza en semillas de tomate. Esto impide una investigación detallada sobre el desarrollo embrionario y de semillas de los tomates.

El hidrato de cloral se utiliza comúnmente como una solución de limpieza que permite que los tejidos y células sumergidos se muestren en diferentes planos ópticos, y preserva sustancialmente las células o componentes tisulares^27,28,29. El protocolo de limpieza basado en hidrato de cloral se ha utilizado con éxito para el aclaramiento de semillas de montaje completo para observar el embrión y el endospermo de Arabidopsis^21,28. Sin embargo, esta solución de limpieza no es eficiente para limpiar las semillas de tomate, que son más impermeables que las semillas de Arabidopsis. Las barreras físicas incluyen: (1) el tegumento del tomate tiene casi 20 capas celulares de 3 a 15 DAF 30,31, (2) el endospermo del tomate es de tipo celular, no de tipo nuclear 32, y (3) las semillas de tomate son aproximadamente 70 veces más grandes en tamaño^33,34 y (4) producen grandes cantidades de mucílago de recubrimiento de semillas^, lo que bloquea la penetración de los reactivos de limpieza y afecta la visualización de las células embrionarias.

Por lo tanto, este informe presenta un método optimizado de limpieza basado en hidrato de cloral para la limpieza de semillas de tomate de montaje completo en diferentes etapas, lo que permite obtener imágenes profundas del proceso de desarrollo embrionario (Figura 2).

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Prepare el fijador FAA agregando 2.5 ml de formaldehído al 37%, 2.5 ml de ácido acético glacial y 45 ml de etanol al 70% en un tubo de centrífuga de 50 ml. Vortex y almacénelo a 4 °C. Prepare el fijador FAA justo antes de usar.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído al 37% es corrosivo y potencialmente cancerígeno si se expone o inhala. El fijador debe realizarse en una campana extractora mientras se usa el equipo de protección personal adecuado.
2. Prepare la solución de limpieza agregando 5 ml de 100% de glicerol, 40 g de hidrato de cloral y 10 ml de agua destilada en una botella de vidrio de 100 ml envuelta con papel de aluminio. Disuelva con un agitador magnético durante la noche a temperatura ambiente. La solución preparada puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
   PRECAUCIÓN: El hidrato de cloral es cancerígeno y tiene un olor acre. Realice el experimento en una campana extractora y use el equipo de protección personal adecuado. El hidrato de cloral es fácil de delicuescencia en el aire y no debe almacenarse en grandes cantidades. La solución de limpieza puede descomponerse cuando se expone a la luz y debe mantenerse alejada de la luz.
3. Prepare la solución desinfectante agregando 10 ml de hipoclorito de sodio al 6%, 40 ml de agua destilada y 50 μL Tween-20 en un tubo de centrífuga de 50 ml. Vortex y guárdelo a temperatura ambiente. Prepare la solución desinfectante justo antes de usarla.
   NOTA: El contenido efectivo de cloro del hipoclorito de sodio que se ha colocado durante mucho tiempo puede disminuir, y el contenido de hipoclorito de sodio al 6% puede aumentarse de acuerdo con la situación real.

2. Recogida de semillas

1. Sembrar semillas de tomate (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, ver Tabla de materiales) en cuencas cuadradas de 8 cm × 8 cm × 8 cm llenas con una mezcla 1:1 de tierra nutritiva de flores y sustrato (v/v) (ver Tabla de materiales), y cultivar en una sala de crecimiento con períodos claros/oscuros de 16/8 h a 24 ± 2 °C (día) y 18 ± 2 °C (noche), 60%-70% de humedad relativa, y una intensidad de luz de 4.000 Lux. Aproximadamente 6 semanas después, las plantas entraron en la etapa de floración.
2. Etiquete la fecha de floración de las flores independientes en la antesis (el ángulo de apertura de los pétalos es de 90°) y registre el día después de la floración (DAF).
3. Coseche los frutos de 3 a 23 plantas de tomate DAF e inmediatamente póngalas en hielo. Divida las frutas (semillas o embriones) de 3 a 23 DAF en frutas tempranas (3-10 DAF), medianas (11-16 DAF) y tardías (17-23 DAF) (semillas o embriones).
   NOTA: No recoja demasiadas frutas a la vez y asegúrese de que las semillas de cada fruta se eliminen dentro de 1 h para un tratamiento posterior.
4. Para las frutas tempranas, rompa la fruta y colóquela en un portaobjetos, y recoja las semillas frescas cuidadosamente con pinzas de precisión bajo el microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 1x a 4x. Para frutas medias y tardías, rompa la fruta y recoja directamente las semillas frescas con pinzas de precisión.

3. Limpieza de semillas a base de hidrato de cloral

NOTA: En este estudio se compararon los protocolos convencionales³⁵ y optimizados por su eficiencia de limpieza de semillas.

1. Limpieza mediante un protocolo convencional
   1. Colocar inmediatamente las semillas frescas (obtenidas en el paso 2.4) en un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1,5 ml de fijador FAA e incubar en un agitador orbital (5 rpm, ver Tabla de materiales) durante 4 h a temperatura ambiente.
   2. Deshidratar estas semillas en una serie de etanol de 70%, 95% y 100% de etanol (v/v) durante 1 h cada una en un agitador orbital (5 rpm).
   3. Coloque las semillas en 3-5 gotas de solución transparente (~ 100 μL) en el portaobjetos y cubra suavemente la muestra con un cubreobjetos. Reemplace la diapositiva con una sola diapositiva cóncava (consulte la Tabla de materiales) para semillas medias y tardías.
   4. Mantenga estos portaobjetos o portaobjetos cóncavos individuales a temperatura ambiente durante 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 día (9 DAF), 3 días (12 DAF) o 7 días (14 a 22 DAF) dependiendo de las etapas de desarrollo del material de semilla (cuanto más jóvenes sean los materiales, más rápida será la velocidad de limpieza).
   5. Observe las muestras con un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) equipado con una cámara digital (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 10x, 20x y 40x. Ajuste y optimice el brillo de la luz transmitida, el control deslizante DIC y la apertura del condensador en tiempo real para cada muestra y capture imágenes.
2. Borrado mediante el protocolo optimizado
   1. Colocar las semillas frescas (obtenidas en la etapa 2.4) directamente en un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1,5 ml de solución desinfectante (paso 1.3).
      NOTA: El número de semillas recolectadas en el tubo de centrífuga de 2 ml varía según la etapa de desarrollo de las semillas. Los detalles se enumeran en la Tabla 1.
   2. Incubar las muestras en un agitador orbital (30 rpm) a temperatura ambiente durante 3 a 50 minutos hasta que el contorno de la cubierta de semilla más interna sea claramente visible. Deseche la solución desinfectante.
      NOTA: El tiempo de incubación requerido depende de la etapa de desarrollo de la semilla (cuanto más tarde sean las semillas, mayor será el tiempo de incubación). Los detalles se enumeran en la Tabla 1.
   3. Para semillas medias y tardías, transfiera las semillas a un portaobjetos y retire el mucílago de la semilla con fórceps y una aguja de disección bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 1x a 4x. Transfiera las semillas de nuevo al tubo de centrífuga original usando pinzas.
      NOTA: Este paso no es necesario para las semillas tempranas.
   4. Lave las semillas 5 veces con 1,5 ml de agua desionizada, 10 s cada vez. Deseche el agua desionizada.
   5. Agregue una solución de limpieza de 2 × el volumen de las semillas, seguido de un tratamiento al vacío de 0 a 50 minutos (Tabla 1) con una bomba de vacío (ver Tabla de materiales). El tratamiento de vacío intermitente se realiza con cada tratamiento de vacío durante 10 minutos espaciados a intervalos de 10 minutos.
   6. Reemplace con una solución fresca de aclaramiento de 2 × el volumen de las semillas. Mantenga el tubo de centrífuga de 2 ml que contiene las semillas a temperatura ambiente y protegido de la luz durante 30 minutos a 7 días para facilitar la limpieza (Tabla 1). Durante la incubación, para embriones tardíos, reemplace la solución de limpieza diariamente con solución fresca y someta las semillas a un tratamiento de vacío durante 10 minutos.
   7. Prepare las semillas limpias en portaobjetos o portaobjetos cóncavos individuales y observe con el microscopio DIC equipado con una cámara digital con aumentos de 10x, 20x y 40x. Ajuste y optimice el brillo de la luz transmitida, el control deslizante DIC y la apertura del condensador en tiempo real para cada muestra y capture imágenes.

Resultados

Cuando las semillas de tomate se eliminaron utilizando un método convencional como en Arabidopsis, las células densas del endospermo bloquearon la visualización de embriones de tomate tempranos a 3 DAF y 6 DAF (Figura 3A, B). A medida que aumentaba el volumen total del embrión, un embrión globular apenas se distinguía a 9 DAF (Figura 3C). Sin embargo, a medida que el tamaño de la semilla continuó aumentando, su permeabilidad dis...

Discusión

En comparación con la sección mecánica, la tecnología de limpieza es más ventajosa para la obtención de imágenes tridimensionales, ya que conserva la integridad de los tejidos u órganos vegetales¹⁶. Los protocolos de limpieza convencionales a menudo se limitan a muestras pequeñas debido a la penetración más fácil de las soluciones químicas. La semilla de tomate es una muestra problemática para la limpieza de tejidos porque es aproximadamente 70 veces más grande que una semilla de

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S