Um Protocolo de Limpeza Eficiente para o Estudo do Desenvolvimento de Sementes em Tomateiro (Solanum lycopersicum L.)

Resumo

A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. Este protocolo é útil para a limpeza de sementes de tomate em diferentes estágios de desenvolvimento para observar a estrutura embrionária mais fina.

Resumo

O tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais culturas comerciais em todo o mundo. A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. A visualização da estrutura embrionária mais fina dentro de uma semente de tomate é muitas vezes dificultada pela mucilagem do revestimento da semente, tegumento em camadas multicelulares e um endosperma de paredes espessas, que precisa ser resolvido por uma laboriosa seção de incorporação. Uma alternativa mais simples é empregar técnicas de limpeza de tecidos que tornam a semente quase transparente usando agentes químicos. Embora os procedimentos convencionais de limpeza permitam uma visão profunda de sementes menores com um revestimento de sementes mais fino, a limpeza de sementes de tomate continua a ser tecnicamente desafiadora, especialmente nos estágios finais de desenvolvimento.

Apresentamos aqui um protocolo de limpeza rápido e que economiza trabalho para observar o desenvolvimento de sementes de tomate de 3 a 23 dias após a floração, quando a morfologia embrionária está quase completa. Este método combina solução de limpeza à base de hidrato de cloral amplamente utilizada em Arabidopsis com outras modificações, incluindo a omissão de fixação de formalina-aceto-álcool (FAA), a adição de tratamento de hipoclorito de sódio de sementes, remoção da mucilagem de revestimento de sementes amolecida e lavagem e tratamento a vácuo. Este método pode ser aplicado para a limpeza eficiente de sementes de tomateiro em diferentes estágios de desenvolvimento e é útil no monitoramento completo do processo de desenvolvimento de sementes mutantes com boa resolução espacial. Este protocolo de limpeza também pode ser aplicado a imagens profundas de outras espécies comercialmente importantes nas Solanaceae.

Introdução

O tomate (S. lycopersicum L.) é uma das culturas vegetais mais importantes do mundo, com uma produção de 186,8 milhões de toneladas de frutos carnudos de 5,1 milhões de hectares em 2020¹. Pertence à grande família Solanaceae com cerca de 2.716 espécies², incluindo muitas culturas comercialmente importantes, como berinjela, pimenta, batata e tabaco. O tomateiro cultivado é uma espécie diploide (2n = 2x = 24) com um tamanho de genoma de aproximadamente 900 Mb³. Durante muito tempo, um grande esforço tem sido feito para a domesticação e reprodução do tomate, selecionando características desejáveis de Solanum spp selvagem. Existem mais de 5.000 acessos de tomate listados no Tomato Genetics Resource Center e mais de 80.000 germoplasma de tomates são armazenados em todo o mundo⁴. A planta de tomate é perene na estufa e se propaga por sementes. Uma semente de tomate madura consiste em três compartimentos principais: um embrião adulto, endosperma residual do tipo celular e um revestimento de sementes duras ^5,6 (Figura 1A). Após a dupla fertilização, o desenvolvimento de endospermas do tipo celular precede o desenvolvimento de zigotos. Em ~5-6 dias após a floração (DAF), o proembrião de duas células é observado pela primeira vez quando o endosperma consiste de seis a oito núcleos⁷. Em Solanum pimpinellifolium, o embrião se aproxima de seu tamanho final após 20 DAF, e as sementes são viáveis para germinação após 32 DAF⁸. À medida que o embrião se desenvolve, o endosperma é gradualmente absorvido e apenas uma pequena quantidade de endosperma permanece na semente. O endosperma residual consiste em endosperma micropilar ao redor da ponta da radícula e endosperma lateral no restante da semente ^9,10. O revestimento externo da semente é desenvolvido a partir da epiderme externa espessada e lignificada do tegumento e, com as camadas mortas de restos de tegumento, formam uma casca dura para proteger o embrião e o endosperma⁵.

Figura 1: Representação esquemática de uma semente madura em Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinal de uma semente de tomateiro madura. (B) Anatomia longitudinal de uma semente madura de Arabidopsis. Uma semente de tomate madura é aproximadamente 70 vezes maior em tamanho do que uma semente de Arabidopsis. Barras de escala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A produção de sementes de tomate de alta qualidade depende da coordenação entre o embrião, o endosperma e os componentes maternos das sementes¹¹. Dissecar genes-chave e redes no desenvolvimento de sementes requer um registro fenotípico profundo e completo de sementes mutantes. Técnicas convencionais de embutimento-seccionamento, como a seção semifina e a seção de parafina, são amplamente aplicadas às sementes de tomateiro para observar as estruturas locais e mais finas do embrião^12,13,14,15. No entanto, a análise do desenvolvimento de sementes a partir de seções finas é geralmente trabalhosa e carece de resolução espacial do eixo z. Em comparação, a depuração tecidual é um método rápido e eficiente para identificar o estágio de desenvolvimento dos defeitos embrionários com maior probabilidade de ocorrer¹⁶. O método de clareamento reduz a opacidade do tecido interno homogeneizando o índice de refração com um ou mais agentes bioquímicos¹⁶. A limpeza de tecidos inteiros permite a observação de uma estrutura tecidual vegetal sem destruir sua integridade, e a combinação de tecnologia de clareamento e imagens tridimensionais tornou-se uma solução ideal para obter informações sobre a morfologia e o estado de desenvolvimento de um órgão vegetal^17,18. Ao longo dos anos, técnicas de limpeza de sementes têm sido utilizadas em várias espécies vegetais, incluindo Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris^{19,20,21,22,23}. Dentre estas, a tecnologia de limpeza de óvulos de montagem completa tem sido uma abordagem eficiente para o estudo do desenvolvimento de sementes de Arabidopsis, devido ao seu pequeno tamanho, 4-5 camadas da célula do revestimento da semente e o endosperma do tipo nuclear^24,25. Com a atualização contínua de diferentes misturas de clareamento, como o surgimento da solução de Hoyer²⁶, as estruturas internas do óvulo de cevada foram fotografadas com alto grau de clareza, embora seu endosperma constitua a maior parte das sementes. A embriogênese da beterraba sacarina pode ser observada por limpeza combinada com tratamento a vácuo e amolecimento com ácido clorídrico¹⁹. No entanto, ao contrário das espécies mencionadas acima, observações embriológicas por protocolos de limpeza em sementes de tomate não foram relatadas. Isso evita uma investigação detalhada sobre o desenvolvimento embrionário e de sementes de tomates.

O hidrato de cloral é comumente utilizado como solução de clareamento que permite que os tecidos e células imersos sejam exibidos em diferentes planos ópticos, preserva substancialmente as células ou componentes teciduais^27,28,29. O protocolo de clareamento à base de hidrato de cloral tem sido utilizado com sucesso para a limpeza completa de sementes para observar o embrião e o endosperma de Arabidopsis^21,28. No entanto, esta solução de limpeza não é eficiente na limpeza de sementes de tomate, que são mais impermeáveis do que as sementes de Arabidopsis. As barreiras físicas incluem: (1) o tegumento do tomate tem quase 20 camadas celulares em 3 a 15 DAF 30,31, (2) o endosperma do tomate é do tipo celular, não do tipo nuclear 32, e (3) as sementes de tomate são cerca de 70 vezes maiores em tamanho^33,34 e (4) produzem grandes quantidades de mucilagem do revestimento da semente^, o que bloqueia a penetração de reagentes de limpeza e afeta a visualização das células embrionárias.

Portanto, este relato apresenta um método otimizado de clareamento à base de hidrato de cloral para limpeza integral de sementes de tomateiro em diferentes estágios, o que permite imagens profundas do processo de desenvolvimento embrionário (Figura 2).

Protocolo

1. Preparação de soluções

1. Preparar o fixador de FAA adicionando 2,5 mL de formaldeído a 37%, 2,5 mL de ácido acético glacial e 45 mL de etanol a 70% em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo a 4 °C. Prepare recentemente o fixador FAA imediatamente antes de usar.
   CUIDADO: 37% de formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno se exposto ou inalado. O fixador deve ser realizado em um exaustor enquanto estiver usando o equipamento de proteção individual apropriado.
2. Prepare a solução de limpeza adicionando 5 mL de glicerol a 100%, 40 g de hidrato de cloral e 10 mL de água destilada em um frasco de vidro de 100 mL envolto com papel alumínio. Dissolva usando um agitador magnético durante a noite à temperatura ambiente. A solução preparada pode ser armazenada a 4 °C por até 6 meses.
   CUIDADO: O hidrato de cloral é cancerígeno e tem um cheiro pungente. Realize o experimento em um exaustor e use o equipamento de proteção individual apropriado. O hidrato de cloral é fácil de deliquesce no ar e não deve ser armazenado em grandes quantidades. A solução de limpeza pode se decompor quando exposta à luz e deve ser mantida longe da luz.
3. Prepare a solução desinfetante adicionando 10 mL de hipoclorito de sódio a 6%, 40 mL de água destilada e 50 μL Tween-20 em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo à temperatura ambiente. Prepare recentemente a solução desinfetante imediatamente antes de utilizar.
   NOTA: O teor efetivo de cloro do hipoclorito de sódio que foi colocado por um longo tempo pode diminuir, e o teor de hipoclorito de sódio a 6% pode ser aumentado de acordo com a situação real.

2. Coleta de sementes

1. Semear sementes de tomate (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, ver Tabela de Materiais) em 8 cm × 8 cm × 8 cm bacias quadradas cheias com uma mistura 1:1 de solo e substrato de nutrientes florais (v/v) (ver Tabela de Materiais), e crescer numa sala de crescimento com períodos claros/escuros de 16/8 h a 24 ± 2 °C (dia) e 18 ± 2 °C (noite), 60%-70% de umidade relativa e uma intensidade de luz de 4.000 Lux. Aproximadamente 6 semanas depois, as plantas entraram no estágio de floração.
2. Marque a data de floração das flores independentes na antese (o ângulo de abertura das pétalas é de 90°) e registre o dia após a floração (DAF).
3. Colha os frutos de 3 a 23 plantas de tomate DAF e coloque-os imediatamente no gelo. Divida os frutos (sementes ou embriões) de 3 a 23 DAF em frutos precoces (3-10 DAF), médios (11-16 DAF) e tardios (17-23 DAF) (sementes ou embriões).
   NOTA: Não colete muitos frutos de cada vez e certifique-se de que as sementes em cada fruto sejam retiradas dentro de 1 h para tratamento adicional.
4. Para frutos precoces, quebre a fruta e coloque-a em uma lâmina e colete sementes frescas cuidadosamente com pinças de precisão sob o estereomicroscópio (veja Tabela de Materiais) com ampliação de 1x a 4x. Para frutos médios e tardios, quebre os frutos e colete diretamente sementes frescas usando pinça de precisão.

3. Limpeza de sementes à base de hidrato de cloral

NOTA: Protocolos convencionais³⁵ e otimizados foram comparados neste estudo quanto à sua eficiência de limpeza de sementes.

1. Limpeza usando um protocolo convencional
   1. Colocar imediatamente as sementes frescas (obtidas na etapa 2.4) num tubo de centrífuga de 2 ml contendo 1,5 ml de fixador FAA e incubar num agitador orbital (5 rpm, ver Tabela de Materiais) durante 4 h à temperatura ambiente.
   2. Desidratar essas sementes em uma série de etanol de 70%, 95% e 100% de etanol (v/v) por 1 h cada em um agitador orbital (5 rpm).
   3. Coloque as sementes em 3-5 gotas de solução de limpeza (~ 100 μL) na lâmina e cubra suavemente a amostra com uma folha de cobertura. Substitua o slide por um único slide côncavo (consulte Tabela de materiais) para sementes médias e tardias.
   4. Mantenha essas lâminas ou lâminas côncavas únicas à temperatura ambiente por 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 dia (9 DAF), 3 dias (12 DAF) ou 7 dias (14 a 22 DAF), dependendo dos estágios de desenvolvimento do material de semente (quanto mais jovens os materiais, mais rápida a velocidade de limpeza).
   5. Observe as amostras com um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) equipado com uma câmera digital (consulte Tabela de Materiais) na ampliação de 10x, 20x e 40x. Ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture imagens.
2. Limpando usando o protocolo otimizado
   1. Colocar as sementes frescas (obtidas no passo 2.4) directamente num tubo de centrifugação de 2 ml contendo 1,5 ml de solução desinfetante (passo 1.3).
      NOTA: O número de sementes coletadas no tubo de centrífuga de 2 mL varia de acordo com o estágio de desenvolvimento das sementes. Os detalhes estão listados na Tabela 1.
   2. Incubar as amostras num agitador orbital (30 rpm) à temperatura ambiente durante 3 a 50 minutos até que o contorno do revestimento mais interno das sementes seja claramente visível. Rejeitar a solução desinfetante.
      NOTA: O tempo de incubação necessário depende do estágio de desenvolvimento das sementes (quanto mais tarde as sementes, maior será o tempo de incubação). Os detalhes estão listados na Tabela 1.
   3. Para sementes médias e tardias, transfira as sementes para uma lâmina e remova a mucilagem da semente com fórceps e uma agulha dissecante sob um estereomicroscópio com ampliação de 1x a 4x. Transfira as sementes de volta para o tubo de centrífuga original usando pinças.
      NOTA: Esta etapa não é necessária para sementes precoces.
   4. Lave as sementes 5x com 1,5 mL de água deionizada, 10 s de cada vez. Descarte a água deionizada.
   5. Adicionar uma solução de limpeza de 2 × volume das sementes, seguida de tratamento a vácuo durante 0 a 50 min (Quadro 1) com uma bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais). O tratamento a vácuo intermitente é realizado com cada tratamento a vácuo por 10 minutos espaçados em intervalos de 10 minutos.
   6. Substitua por uma solução de limpeza fresca de 2 × o volume das sementes. Manter o tubo de centrífuga de 2 mL contendo as sementes em temperatura ambiente e protegido da luz por 30 min a 7 dias para facilitar a limpeza (Tabela 1). Durante a incubação, para embriões tardios, substitua a solução de limpeza diariamente por solução fresca e submeta as sementes ao tratamento a vácuo por 10 min.
   7. Prepare as sementes limpas em lâminas ou lâminas côncavas simples e observe com o microscópio DIC equipado com uma câmera digital de ampliação de 10x, 20x e 40x. Ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture imagens.

Resultados

Quando as sementes de tomate foram limpas usando um método convencional como em Arabidopsis, os densos nódulos endospermáticos bloquearam a visualização de embriões de tomate precoces em 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A,B). À medida que o volume total do embrião aumentava, um embrião globular era quase indistinguível a 9 DAF (Figura 3C). No entanto, à medida que o tamanho da semente continuou a aumentar, sua permeabilidade diminuiu, ...

Discussão

Em comparação com o corte mecânico, a tecnologia de limpeza é mais vantajosa para imagens tridimensionais, pois mantém a integridade dos tecidos ou órgãos vegetais¹⁶. Os protocolos de limpeza convencionais são frequentemente limitados a pequenas amostras devido à penetração mais fácil de soluções químicas. A semente de tomate é uma amostra problemática para a limpeza de tecidos porque é cerca de 70 vezes maior do que uma semente de Arabidopsis em tamanho e tem mais barre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S