Ein effizientes Clearing-Protokoll zur Untersuchung der Saatgutentwicklung bei Tomaten (Solanum lycopersicum L.)

Zusammenfassung

Der Tomatensamen ist ein wichtiges Modell für das Studium der Genetik und Entwicklungsbiologie während der Pflanzenvermehrung. Dieses Protokoll ist nützlich, um Tomatensamen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu entfernen, um die feinere embryonale Struktur zu beobachten.

Zusammenfassung

Tomate (Solanum lycopersicum L.) ist eine der wichtigsten Cash Crops weltweit. Der Tomatensamen ist ein wichtiges Modell für das Studium der Genetik und Entwicklungsbiologie während der Pflanzenvermehrung. Die Visualisierung einer feineren embryonalen Struktur innerhalb eines Tomatensamens wird oft durch Samenhüllenschleim, mehrzellige Schichtintegument und ein dickwandiges Endosperm behindert, das durch mühsames Einbetten aufgelöst werden muss. Eine einfachere Alternative ist der Einsatz von Gewebereinigungstechniken, die das Saatgut mit chemischen Mitteln nahezu transparent machen. Obwohl herkömmliche Clearingverfahren einen tiefen Einblick in kleinere Samen mit dünnerer Samenhülle ermöglichen, ist die Klärung von Tomatensamen vor allem in den späten Entwicklungsstadien eine technische Herausforderung.

Hier wird ein schnelles und arbeitssparendes Clearing-Protokoll vorgestellt, um die Entwicklung von Tomatensamen 3 bis 23 Tage nach der Blüte zu beobachten, wenn die embryonale Morphologie fast abgeschlossen ist. Diese Methode kombiniert eine in Arabidopsis weit verbreitete Chloralhydrat-basierte Reinigungslösung mit anderen Modifikationen, einschließlich des Wegfalls der Formalin-Aceto-Alkohol (FAA) -Fixierung, der Zugabe von Natriumhypochlorit-Behandlung von Samen, der Entfernung der erweichten Samenschichtschleimhaut sowie des Waschens und der Vakuumbehandlung. Diese Methode kann zur effizienten Reinigung von Tomatensamen in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden und ist nützlich bei der vollständigen Überwachung des Entwicklungsprozesses von mutierten Samen mit guter räumlicher Auflösung. Dieses Clearing-Protokoll kann auch auf die Tiefenbildgebung anderer kommerziell wichtiger Arten in den Solanaceae angewendet werden.

Einleitung

Tomate (S. lycopersicum L.) ist eine der wichtigsten Gemüsekulturen der Welt, mit einer Produktion von 186,8 Millionen Tonnen fleischigen Früchten von 5,1 Millionen Hektar im Jahr 2020¹. Es gehört zur großen Familie der Solanaceae mit etwa 2.716 Arten², darunter viele kommerziell wichtige Kulturen wie Auberginen, Paprika, Kartoffeln und Tabak. Die Kulturtomate ist eine diploide Art (2n = 2x = 24) mit einer Genomgröße von ca. 900^Mb3. Seit langem werden große Anstrengungen unternommen, um Tomatendomestizierung und -züchtung zu züchten, indem wünschenswerte Merkmale aus wilden Solanum spp. Es gibt über 5.000 Tomatenakzessionen, die im Tomato Genetics Resource Center aufgeführt sind, und mehr als 80.000 Keimplasma von Tomaten werden weltweit gelagert⁴. Die Tomatenpflanze ist mehrjährig im Gewächshaus und vermehrt sich durch Samen. Ein reifer Tomatensamen besteht aus drei Hauptkompartimenten: einem ausgewachsenen Embryo, einem zellulären Endosperm und einer harten Samenschale ^5,6 (Abbildung 1A). Nach doppelter Befruchtung geht die Entwicklung von zellulärem Endosperm der Entwicklung von Zygoten voraus. Bei ~5-6 Tagen nach der Blüte (DAF) wird erstmals ein zweizelliger Proembryo beobachtet, wenn das Endosperm aus sechs bis acht Kernen besteht⁷. Bei Solanum pimpinellifolium nähert sich der Embryo nach 20 DAF seiner endgültigen Größe, und die Samen sind nach 32 DAF⁸ für die Keimung geeignet. Wenn sich der Embryo entwickelt, wird das Endosperm allmählich absorbiert und nur eine kleine Menge Endosperm verbleibt im Samen. Das restliche Endosperm besteht aus mikropylarem Endosperm, das die Radikelspitze umgibt, und seitlichem Endosperm im Rest des Samens ^9,10. Die äußere Samenhülle wird aus verdickter und verholzter äußerer Epidermis des Integuments entwickelt, und mit den abgestorbenen Schichten von Integumentresten bilden sie eine harte Schale, um den Embryo und das Endosperm zu schützen⁵.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines reifen Samens in Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana. (A) Längsanatomie eines reifen Tomatensamens. (B) Längsanatomie eines reifen Arabidopsis-Samens. Ein reifer Tomatensamen ist etwa 70-mal größer als ein Arabidopsis-Samen. Maßstabsbalken = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Produktion hochwertiger Tomatensamen hängt von der Koordination zwischen dem Embryo, dem Endosperm und den mütterlichen Samenbestandteilen ab¹¹. Die Analyse von Schlüsselgenen und Netzwerken in der Samenentwicklung erfordert eine tiefe und vollständige phänotypische Aufzeichnung von mutierten Samen. Konventionelle Einbettungsschnitttechniken, wie der Halbdünnschliff und der Paraffinschnitt, werden häufig auf Tomatensamen angewendet, um die lokalen und feineren Strukturen des Embryos^{zu beobachten 12,13,14,15}. Die Analyse der Seed-Entwicklung aus dünnen Schnitten ist jedoch in der Regel mühsam und es fehlt die räumliche Auflösung der z-Achse. Im Vergleich dazu ist die Gewebereinigung eine schnelle und effiziente Methode, um das Entwicklungsstadium von embryonalen Defekten zu bestimmen, die am wahrscheinlichsten auftreten¹⁶. Das Clearing-Verfahren verringert die Undurchsichtigkeit des inneren Gewebes durch Homogenisierung des Brechungsindex mit einem oder mehreren biochemischen Mitteln¹⁶. Die gesamte Gewebereinigung ermöglicht die Beobachtung einer pflanzlichen Gewebestruktur, ohne ihre Integrität zu zerstören, und die Kombination von Clearing-Technologie und dreidimensionaler Bildgebung ist zu einer idealen Lösung geworden, um Informationen über die Morphologie und den Entwicklungszustand eines Pflanzenorgans zu erhalten^17,18. Im Laufe der Jahre wurden Samenreinigungstechniken bei verschiedenen Pflanzenarten eingesetzt, darunter Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare und Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Unter diesen war die Whole-mount-Eizellenreinigungstechnologie ein effizienter Ansatz zur Untersuchung der Samenentwicklung von Arabidopsis, aufgrund ihrer geringen Größe, 4-5 Schichten der Samenhüllenzelle und des nuklearen Endosperms^24,25. Mit der kontinuierlichen Aktualisierung verschiedener Clearing-Mischungen, wie dem Auftauchen der Hoyer-Lösung²⁶, wurden die inneren Strukturen der Gerstenzelle mit einem hohen Grad an Klarheit abgebildet, obwohl ihr Endosperm den Großteil der Samen ausmacht. Die Embryogenese von Zuckerrüben kann durch Reinigung in Kombination mit Vakuumbehandlung und Erweichung mit Salzsäure^{beobachtet werden 19}. Im Gegensatz zu den oben genannten Arten wurden jedoch keine embryologischen Beobachtungen durch Clearing-Protokolle in Tomatensamen berichtet. Dies verhindert eine detaillierte Untersuchung der Embryonal- und Samenentwicklung von Tomaten.

Chloralhydrat wird üblicherweise als Reinigungslösung verwendet, die es ermöglicht, die eingetauchten Gewebe und Zellen auf verschiedenen optischen Ebenen darzustellen und die Zellen oder Gewebekomponenten im Wesentlichen zu erhalten 27,28,29. Das auf Chloralhydrat basierende Clearing-Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Reinigung von Samen verwendet, um den Embryo und das Endosperm von Arabidopsis^21,28 zu beobachten. Diese Clearing-Lösung ist jedoch nicht effizient bei der Reinigung von Tomatensamen, die undurchlässiger sind als Arabidopsis-Samen. Zu den physischen Barrieren gehören: (1) das Tomatenintegument hat fast 20 Zellschichten bei 3 bis 15 DAF 30,31, (2) das Tomatenendosperm ist zellulär, nicht vom Kerntyp 32, und (3) Tomatensamen sind etwa^70-mal größer in der Größe^33,34 und (4) produzieren große Mengen an Samenmantelschleimstoffen^, die das Eindringen von Reinigungsreagenzien blockieren und die Visualisierung von Embryozellen beeinträchtigen.

Daher stellt dieser Bericht eine optimierte Chloralhydrat-basierte Clearing-Methode für die vollständige Reinigung von Tomatensamen in verschiedenen Stadien vor, die eine tiefe Bildgebung des Embryo-Entwicklungsprozesses ermöglicht (Abbildung 2).

Protokoll

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie das FAA-Fixiermittel durch Zugabe von 2,5 ml 37% Formaldehyd, 2,5 ml Eisessig und 45 ml 70% Ethanol in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Vortex und lagern Sie es bei 4 °C. FAA Fixiermittel kurz vor Gebrauch frisch zubereiten.
   ACHTUNG: 37% Formaldehyd ist ätzend und potenziell krebserregend, wenn es exponiert oder eingeatmet wird. Das Fixiermittel muss in einem Abzug unter Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
2. Bereiten Sie die Reinigungslösung vor, indem Sie 5 ml 100% Glycerin, 40 g Chloralhydrat und 10 ml destilliertes Wasser in einer 100-ml-Glasflasche hinzufügen, die mit Zinnfolie umwickelt ist. Mit einem Magnetrührer über Nacht bei Raumtemperatur auflösen. Die vorbereitete Lösung kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
   ACHTUNG: Chloralhydrat ist krebserregend und riecht stechend. Führen Sie das Experiment in einem Abzug durch und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung. Chloralhydrat lässt sich leicht in der Luft entwässern und sollte nicht in großen Mengen gelagert werden. Die Reinigungslösung kann sich bei Lichteinwirkung zersetzen und sollte von Licht ferngehalten werden.
3. Bereiten Sie die Desinfektionslösung vor, indem Sie 10 ml 6% Natriumhypochlorit, 40 ml destilliertes Wasser und 50 μL Tween-20 in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzufügen. Vortex und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Desinfektionslösung kurz vor Gebrauch frisch zu.
   HINWEIS: Der effektive Chlorgehalt von Natriumhypochlorit, der für eine lange Zeit platziert wurde, kann abnehmen, und der Gehalt an 6% Natriumhypochlorit kann entsprechend der tatsächlichen Situation erhöht werden.

2. Saatgutsammlung

1. Tomatensamen (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, siehe Materialtabelle) in 8 cm × 8 cm × 8 cm großen quadratischen Becken mit einer 1:1-Mischung aus Blütennährstofferde und Substrat (v/v) aussäen (siehe Materialtabelle) und wachsen in einem Wachstumsraum mit 16/8 h Hell-Dunkel-Perioden bei 24 ± 2 °C (Tag) und 18 ± 2 °C (Nacht), 60% -70% relative Luftfeuchtigkeit und eine Lichtintensität von 4.000 Lux. Etwa 6 Wochen später traten die Pflanzen in die Blütephase ein.
2. Markieren Sie das Blütedatum unabhängiger Blüten an der Anthese (Öffnungswinkel der Blütenblätter beträgt 90°) und notieren Sie den Tag nach der Blüte (DAF).
3. Ernten Sie die Früchte von 3 bis 23 DAF-Tomatenpflanzen und legen Sie sie sofort auf Eis. Teilen Sie Früchte (Samen oder Embryonen) von 3 bis 23 DAF in frühe (3-10 DAF), mittlere (11-16 DAF) und späte (17-23 DAF) Früchte (Samen oder Embryonen).
   HINWEIS: Sammeln Sie nicht zu viele Früchte auf einmal und stellen Sie sicher, dass die Samen in jeder Frucht innerhalb von 1 Stunde zur weiteren Behandlung entfernt werden.
4. Für frühe Früchte brechen Sie die Früchte und legen Sie sie auf einen Objektträger und sammeln Sie frische Samen sorgfältig mit einer Präzisionszange unter dem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle) bei 1x bis 4-facher Vergrößerung. Für mittlere und späte Früchte brechen Sie die Früchte und sammeln Sie frische Samen direkt mit einer Präzisionszange.

3. Chloralhydrat-basierte Reinigung von Samen

HINWEIS: Konventionelle³⁵ und optimierte Protokolle wurden in dieser Studie hinsichtlich ihrer Saatgutreinigungseffizienz verglichen.

1. Clearing mit einem herkömmlichen Protokoll
   1. Frisches Saatgut (erhalten in Schritt 2.4) sofort in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml FAA-Fixiermittel geben und auf einem Orbitalschüttler (5 U/min, siehe Materialtabelle) 4 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Dehydrieren Sie diese Samen in einer Ethanolserie von 70%, 95% und 100% Ethanol (v / v) für jeweils 1 h auf einem Orbitalschüttler (5 U/min).
   3. Legen Sie die Samen in 3-5 Tropfen Reinigungslösung (~ 100 μL) auf den Objektträger und bedecken Sie die Probe vorsichtig mit einem Deckglas. Ersetzen Sie den Objektträger durch einen einzelnen konkaven Objektträger (siehe Materialtabelle) für mittlere und späte Samen.
   4. Bewahren Sie diese Objektträger oder einzelnen konkaven Objektträger bei Raumtemperatur für 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 Tag (9 DAF), 3 Tage (12 DAF) oder 7 Tage (14 bis 22 DAF) auf, abhängig von den Entwicklungsstadien des Saatguts (je jünger die Materialien, desto schneller die Clearing-Geschwindigkeit).
   5. Beobachten Sie die Proben mit einem DIC-Mikroskop (Differential Interference Contrast), das mit einer Digitalkamera (siehe Materialtabelle) bei 10-facher, 20-facher und 40-facher Vergrößerung ausgestattet ist. Passen Sie die Durchlichthelligkeit, den DIC-Schieberegler und die Kondensatorblende in Echtzeit für jede Probe an und optimieren Sie sie.
2. Clearing mit dem optimierten Protokoll
   1. Frisches Saatgut (erhalten in Schritt 2.4) wird direkt in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml Desinfektionslösung gegeben (Schritt 1.3).
      HINWEIS: Die Anzahl der Samen, die in der 2-ml-Zentrifugenröhre gesammelt werden, variiert je nach Entwicklungsstadium der Samen. Einzelheiten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   2. Inkubieren Sie die Proben auf einem Orbitalschüttler (30 U/min) bei Raumtemperatur für 3 bis 50 Minuten, bis der innerste Saatmantelumriss deutlich sichtbar ist. Entsorgen Sie die Desinfektionslösung.
      HINWEIS: Die erforderliche Inkubationszeit hängt vom Saatgutentwicklungsstadium ab (je später die Samen, desto länger ist die Inkubationszeit). Einzelheiten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   3. Bei mittleren und späten Samen die Samen auf einen Objektträger übertragen und den Samenschleim mit einer Pinzette und einer Seziernadel unter einem Stereomikroskop bei 1- bis 4-facher Vergrößerung entfernen. Die Samen werden mit einer Pinzette wieder in das ursprüngliche Zentrifugenröhrchen überführt.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist für frühe Samen nicht erforderlich.
   4. Waschen Sie die Samen 5x mit 1,5 ml entionisiertem Wasser, jeweils 10 s. Entsorgen Sie das entionisierte Wasser.
   5. Eine Reinigungslösung von 2 × Volumen der Samen zugeben, gefolgt von einer Vakuumbehandlung für 0 bis 50 min (Tabelle 1) mit einer Vakuumpumpe (siehe Materialtabelle). Die intermittierende Vakuumbehandlung wird mit jeder Vakuumbehandlung für 10 Minuten im Abstand von 10 Minuten durchgeführt.
   6. Ersetzen Sie durch eine frische Reinigungslösung von 2 × Volumen der Samen. Bewahren Sie das 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit den Samen 30 Minuten bis 7 Tage lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt auf, um die Reinigung zu erleichtern (Tabelle 1). Während der Inkubation wird bei späten Embryonen die Clearing-Lösung täglich durch frische Lösung ersetzt und die Samen 10 min lang einer Vakuumbehandlung unterzogen.
   7. Bereiten Sie die geklärten Samen auf Objektträgern oder einfach konkaven Objektträgern vor und beobachten Sie sie mit dem DIC-Mikroskop, das mit einer Digitalkamera in 10-facher, 20-facher und 40-facher Vergrößerung ausgestattet ist. Passen Sie die Durchlichthelligkeit, den DIC-Schieberegler und die Kondensatorblende in Echtzeit für jede Probe an und optimieren Sie sie.

Ergebnisse

Wenn Tomatensamen mit einer herkömmlichen Methode wie bei Arabidopsis entfernt wurden, blockierten dichte Endospermzellen die Visualisierung früher Tomatenembryonen bei 3 DAF und 6 DAF (Abbildung 3A,B). Als das Gesamtvolumen des Embryos zunahm, war ein kugelförmiger Embryo bei 9 DAF kaum zu unterscheiden (Abbildung 3C). Als die Samengröße jedoch weiter zunahm, nahm ihre Permeabilität ab, was zu einem unscharfen Herzembryo bei 12 D...

Diskussion

Im Vergleich zum mechanischen Schneiden ist die Clearing-Technologie für die dreidimensionale Bildgebung vorteilhafter, da sie die Integrität von Pflanzengeweben oder Organen bewahrt¹⁶. Herkömmliche Clearing-Protokolle sind aufgrund des leichteren Eindringens chemischer Lösungen oft auf kleine Proben beschränkt. Tomatensamen sind eine problematische Probe für die Gewebereinigung, da sie etwa 70-mal größer sind als ein Arabidopsis-Samen und mehr Durchlässigkeitsbarrieren aufweisen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S