Un protocole de défrichement efficace pour l’étude du développement des semences de tomates (Solanum lycopersicum L.)

Résumé

La graine de tomate est un modèle important pour étudier la génétique et la biologie du développement pendant la reproduction des plantes. Ce protocole est utile pour éliminer les graines de tomates à différents stades de développement afin d’observer la structure embryonnaire plus fine.

Résumé

La tomate (Solanum lycopersicum L.) est l’une des principales cultures commerciales au monde. La graine de tomate est un modèle important pour étudier la génétique et la biologie du développement pendant la reproduction des plantes. La visualisation d’une structure embryonnaire plus fine dans une graine de tomate est souvent entravée par le mucilage du tégument, le tégument multicellulaire et un endosperme à paroi épaisse, qui doit être résolu par une encastre-section laborieuse. Une alternative plus simple consiste à utiliser des techniques de nettoyage des tissus qui rendent la graine presque transparente à l’aide d’agents chimiques. Bien que les procédures de défrichage conventionnelles permettent de mieux comprendre les petites graines avec un tégument plus mince, le défrichement des semences de tomates continue d’être techniquement difficile, en particulier dans les derniers stades de développement.

Un protocole de défrichement rapide et économique permet d’observer le développement des graines de tomates de 3 à 23 jours après la floraison, lorsque la morphologie embryonnaire est presque terminée. Cette méthode combine une solution de nettoyage à base d’hydrate de chloral largement utilisée chez Arabidopsis avec d’autres modifications, y compris l’omission de la fixation formol-acéto-alcool (FAA), l’ajout d’un traitement à l’hypochlorite de sodium des graines, l’élimination du mucilage ramolli du tégument et le lavage et le traitement sous vide. Cette méthode peut être appliquée pour un nettoyage efficace des graines de tomates à différents stades de développement et est utile pour le suivi complet du processus de développement des graines mutantes avec une bonne résolution spatiale. Ce protocole de défrichage peut également être appliqué à l’imagerie en profondeur d’autres espèces commercialement importantes dans les Solanaceae.

Introduction

La tomate (S. lycopersicum L.) est l’une des cultures légumières les plus importantes au monde, avec une production de 186,8 millions de tonnes de fruits charnus sur 5,1 millions d’hectares en 2020¹. Il appartient à la grande famille des solanacées avec environ 2 716 espèces², y compris de nombreuses cultures commercialement importantes telles que l’aubergine, les poivrons, la pomme de terre et le tabac. La tomate cultivée est une espèce diploïde (2n = 2x = 24) avec une taille de génome d’environ 900 Mb³. Pendant longtemps, de grands efforts ont été faits pour la domestication et la reproduction de la tomate en sélectionnant des caractères souhaitables chez Solanum spp. Il y a plus de 5 000 accessions de tomates répertoriées dans le Centre de ressources génétiques sur la tomate et plus de 80 000 germoplasmes de tomates sont stockés dans le monde⁴. Le plant de tomate est vivace en serre et se propage par graines. Une graine de tomate mature se compose de trois compartiments principaux : un embryon adulte, un endosperme résiduel de type cellulaire et un tégument dur ^5,6 (figure 1A). Après une double fécondation, le développement de l’endosperme de type cellulaire précède le développement des zygotes. À ~5-6 jours après la floraison (DAF), le proembryon bicellulaire est observé pour la première fois lorsque l’endosperme est constitué de six à huit noyaux⁷. Chez Solanum pimpinellifolium, l’embryon approche de sa taille finale après 20 DAF, et les graines sont viables pour la germination après 32 DAF⁸. Au fur et à mesure que l’embryon se développe, l’endosperme est progressivement absorbé et seule une petite quantité d’endosperme reste dans la graine. L’endosperme résiduel est constitué d’endosperme micropylaire entourant l’extrémité radiculaire et d’endosperme latéral dans le reste de la graine ^9,10. Le tégument externe est développé à partir de l’épiderme externe épaissi et lignifié du tégument, et avec les couches mortes de restes de tégument, ils forment une coquille dure pour protéger l’embryon et l’endosperme⁵.

Figure 1 : Représentation schématique d’une graine mature chez Solanum lycopersicum et Arabidopsis thaliana. (A) Anatomie longitudinale d’une graine de tomate mature. (B) Anatomie longitudinale d’une graine d’Arabidopsis mature. Une graine de tomate mûre est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’Arabidopsis. Barres d’échelle = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La production de semences de tomates de haute qualité dépend de la coordination entre l’embryon, l’endosperme et les composants maternels^{des semences 11}. La dissection de gènes et de réseaux clés dans le développement des semences nécessite un enregistrement phénotypique approfondi et complet des graines mutantes. Les techniques conventionnelles d’encastrement-section, telles que la section semi-mince et la section de paraffine, sont largement appliquées aux graines de tomates pour observer les structures locales et plus fines de l’embryon^12,13,14,15. Cependant, l’analyse du développement des graines à partir de sections minces est généralement laborieuse et manque de résolution spatiale de l’axe z. En comparaison, la clairsemage tissulaire est une méthode rapide et efficace pour déterminer le stade de développement des anomalies embryonnaires les plus susceptibles de se produire¹⁶. La méthode de nettoyage réduit l’opacité des tissus internes en homogénéisant l’indice de réfraction avec un ou plusieurs agents biochimiques¹⁶. Le nettoyage des tissus entiers permet d’observer la structure d’un tissu végétal sans détruire son intégrité, et la combinaison de la technologie de nettoyage et de l’imagerie tridimensionnelle est devenue une solution idéale pour obtenir des informations sur la morphologie et l’état de développement d’un organe végétal^17,18. Au fil des ans, des techniques de débroussaillage ont été utilisées chez diverses espèces végétales, notamment Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare et Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Parmi celles-ci, la technologie de défrichage des ovules à montage entier a été une approche efficace pour étudier le développement des graines d’Arabidopsis, en raison de sa petite taille, de ses 4-5 couches de cellules de tégument et de l’endosperme de type nucléaire^24,25. Avec la mise à jour continue de différents mélanges de nettoyage, tels que l’émergence de la solution²⁶ de Hoyer, les structures internes de l’ovule d’orge ont été imagées avec un haut degré de clarté, bien que son endosperme constitue la majeure partie des graines. L’embryogenèse de la betterave sucrière peut être observée par débroussaillage combiné à un traitement sous vide et ramollissement à l’acide chlorhydrique¹⁹. Néanmoins, contrairement aux espèces mentionnées ci-dessus, les observations embryologiques par protocoles de nettoyage dans les graines de tomates n’ont pas été rapportées. Cela empêche une étude détaillée du développement embryonnaire et des semences de tomates.

L’hydrate de chloral est couramment utilisé comme solution de compensation qui permet aux tissus immergés et aux cellules d’être affichés sur différents plans optiques et préserve considérablement les cellules ou les composants tissulaires^27,28,29. Le protocole de nettoyage à base d’hydrate de chloral a été utilisé avec succès pour le nettoyage complet des graines afin d’observer l’embryon et l’endosperme d’Arabidopsis^21,28. Cependant, cette solution de nettoyage n’est pas efficace pour éliminer les graines de tomates, qui sont plus imperméables que les graines d’Arabidopsis. Les barrières physiques comprennent: (1) le tégument de la tomate a près de 20 couches cellulaires à 3 à 15 DAF 30,31, (2) l’endosperme de la tomate est de type cellulaire, pas de type nucléaire³², et (3) les graines de tomate sont environ 70 fois plus grandes en taille^33,34 et (4) produisent de grandes quantités de mucilage de tégument^, ce qui bloque la pénétration des réactifs d’élimination et affecte la visualisation des cellules embryonnaires.

Par conséquent, ce rapport présente une méthode optimisée de nettoyage à base d’hydrate de chloral pour l’élimination complète des graines de tomates à différents stades, ce qui permet une imagerie approfondie du processus de développement de l’embryon (Figure 2).

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparer le fixateur FAA en ajoutant 2,5 mL de formaldéhyde à 37 %, 2,5 mL d’acide acétique glacial et 45 mL d’éthanol à 70 % dans un tube à centrifuger de 50 mL. Vortex et conserver à 4 °C. Préparer fraîchement le fixateur FAA juste avant utilisation.
   ATTENTION : 37 % de formaldéhyde est corrosif et potentiellement cancérogène en cas d’exposition ou d’inhalation. Le fixateur doit être effectué dans une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
2. Préparer la solution de nettoyage en ajoutant 5 mL de glycérol à 100 %, 40 g d’hydrate de chloral et 10 mL d’eau distillée dans une bouteille en verre de 100 ml enveloppée de papier d’aluminium. Dissoudre à l’aide d’un agitateur magnétique pendant une nuit à température ambiante. La solution préparée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 6 mois.
   ATTENTION : L’hydrate de chloral est cancérigène et dégage une odeur âcre. Effectuez l’expérience dans une hotte et portez un équipement de protection individuelle approprié. L’hydrate de chloral est facile à déliquescer dans l’air et ne doit pas être stocké en grande quantité. La solution de compensation peut se décomposer lorsqu’elle est exposée à la lumière et doit être tenue à l’écart de la lumière.
3. Préparer la solution désinfectante en ajoutant 10 mL d’hypochlorite de sodium à 6 %, 40 mL d’eau distillée et 50 μL de Tween-20 dans un tube à centrifuger de 50 mL. Vortex et stockez-le à température ambiante. Préparez fraîchement la solution désinfectante juste avant utilisation.
   NOTE: La teneur en chlore efficace de l’hypochlorite de sodium qui a été placé pendant une longue période peut diminuer, et la teneur en hypochlorite de sodium à 6% peut être augmentée en fonction de la situation réelle.

2. Collecte des semences

1. Semez des graines de tomates (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, voir tableau des matières) dans des bassins carrés de 8 cm × 8 cm × 8 cm remplis d’un mélange 1:1 de sol nutritif de fleurs et de substrat (v/v) (voir tableau des matières), et poussez dans une salle de croissance avec 16/8 h de périodes lumière/obscurité à 24 ± 2 °C (jour) et 18 ± 2 °C (nuit), 60% à 70% d’humidité relative et une intensité lumineuse de 4 000 Lux. Environ 6 semaines plus tard, les plantes sont entrées dans la phase de floraison.
2. Marquez la date de floraison des fleurs indépendantes à l’anthèse (l’angle d’ouverture des pétales est de 90°) et enregistrez le lendemain de la floraison (DAF).
3. Récoltez les fruits de 3 à 23 plants de tomates DAF et mettez-les immédiatement sur la glace. Répartir les fruits (graines ou embryons) de 3 à 23 DAF en fruits précoces (3-10 DAF), moyens (11-16 DAF) et tardifs (17-23 DAF) (graines ou embryons).
   REMARQUE: Ne récoltez pas trop de fruits à la fois et assurez-vous que les graines de chaque fruit sont dépouillées dans les 1 h pour un traitement ultérieur.
4. Pour les fruits primeurs, cassez le fruit et mettez-le sur une lame, et recueillez soigneusement les graines fraîches avec une pince de précision au stéréomicroscope (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 1x à 4x. Pour les fruits moyens et tardifs, cassez les fruits et collectez directement les graines fraîches à l’aide d’une pince de précision.

3. Élimination des semences à base d’hydrate de chloral

REMARQUE : Les protocoles conventionnels³⁵ et optimisés ont été comparés dans cette étude pour leur efficacité de défrichement des semences.

1. Compensation à l’aide d’un protocole conventionnel
   1. Placer immédiatement les graines fraîches (obtenues à l’étape 2.4) dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 1,5 mL de fixateur FAA et incuber sur un agitateur orbital (5 tr/min, voir le tableau des matières) pendant 4 h à température ambiante.
   2. Déshydrater ces graines dans une série d’éthanol de 70%, 95% et 100% éthanol (v/v) pendant 1 h chacune sur un agitateur orbital (5 rpm).
   3. Placer les graines dans 3 à 5 gouttes de solution de nettoyage (~100 μL) sur la lame et couvrir délicatement l’échantillon d’une lame. Remplacer la lame par une seule lame concave (voir le tableau des matières) pour les graines moyennes et tardives.
   4. Conservez ces lames ou lames concaves simples à température ambiante pendant 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 jour (9 DAF), 3 jours (12 DAF) ou 7 jours (14 à 22 DAF) selon les stades de développement du matériel semencier (plus les matériaux sont jeunes, plus la vitesse de dégagement est rapide).
   5. Observez les échantillons à l’aide d’un microscope à contraste interférentiel différentiel (CIV) équipé d’un appareil photo numérique (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 10x, 20x et 40x. Ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez des images.
2. Effacement à l’aide du protocole optimisé
   1. Placer les graines fraîches (obtenues à l’étape 2.4) directement dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 1,5 mL de solution désinfectante (étape 1.3).
      REMARQUE : Le nombre de graines recueillies dans le tube à centrifuger de 2 ml varie selon le stade de développement des graines. Les détails sont présentés dans le tableau 1.
   2. Incuber les échantillons sur un agitateur orbital (30 rpm) à température ambiante pendant 3 à 50 minutes jusqu’à ce que le contour le plus interne du tégument soit clairement visible. Jetez la solution désinfectante.
      NOTE: Le temps d’incubation requis dépend du stade de développement de la graine (plus les graines sont tardives, plus le temps d’incubation sera long). Les détails sont présentés dans le tableau 1.
   3. Pour les graines moyennes et tardives, transférer les graines sur une lame et retirer le mucilage de la graine avec une pince et une aiguille à dissection sous un stéréomicroscope à un grossissement de 1x à 4x. Transférez les graines dans le tube centrifuge d’origine à l’aide d’une pince.
      REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire pour les graines précoces.
   4. Lavez les graines 5x avec 1,5 mL d’eau désionisée, 10 s à chaque fois. Jetez l’eau désionisée.
   5. Ajouter une solution de nettoyage de 2 × le volume des graines, suivie d’un traitement sous vide pendant 0 à 50 min (tableau 1) avec une pompe à vide (voir tableau des matériaux). Un traitement intermittent sous vide est effectué avec chaque traitement sous vide pendant 10 min espacés de 10 minutes.
   6. Remplacer par une solution de nettoyage fraîche de 2 × le volume des graines. Conserver le tube à centrifuger de 2 ml contenant les graines à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à 7 jours pour faciliter le nettoyage (tableau 1). Pendant l’incubation, pour les embryons tardifs, remplacer quotidiennement la solution de clairance par une solution fraîche et soumettre les graines à un traitement sous vide pendant 10 min.
   7. Préparez les graines dégagées sur des lames ou des lames concaves simples et observez avec le microscope DIC équipé d’un appareil photo numérique à un grossissement de 10x, 20x et 40x. Ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez des images.

Résultats

Lorsque les graines de tomates ont été éliminées à l’aide d’une méthode conventionnelle comme chez Arabidopsis, des cellules endospermatiques denses ont bloqué la visualisation des embryons de tomates précoces à 3 DAF et 6 DAF (Figure 3A,B). Au fur et à mesure que le volume total de l’embryon augmentait, un embryon globulaire était à peine discernable à 9 DAF (Figure 3C). Cependant, à mesure que la taille de la grain...

Discussion

Par rapport à la section mécanique, la technologie de nettoyage est plus avantageuse pour l’imagerie tridimensionnelle car elle conserve l’intégrité des tissus ou organes végétaux¹⁶. Les protocoles de nettoyage conventionnels sont souvent limités à de petits échantillons en raison de la pénétration plus facile des solutions chimiques. La graine de tomate est un échantillon problématique pour le nettoyage des tissus car elle est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’A...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S