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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En este protocolo, la tecnología de procesamiento de aceite de cordero de Epimedii folium (EF) se optimizó aplicando una metodología experimental de superficie de diseño-respuesta de Box-Behnken, y se investigó preliminarmente el efecto de la EF cruda y optimizada extraída en agua en el desarrollo embrionario del pez cebra.

Resumen

Como medicina tradicional china (MTC), Epimedii folium (EF) tiene una historia en medicina y alimentos que tiene > 2.000 años de antigüedad. Clínicamente, la EF procesada con aceite de cordero se usa a menudo como medicamento. En los últimos años, los informes de riesgos de seguridad y reacciones adversas de productos que utilizan FE como materia prima han aumentado gradualmente. El procesamiento puede mejorar efectivamente la seguridad de la MTC. Según la teoría de la MTC, el procesamiento del aceite de cordero puede reducir la toxicidad de la FE y mejorar su efecto tonificante en los riñones. Sin embargo, hay una falta de investigación sistemática y evaluación de la tecnología de procesamiento de aceite de cordero EF. En este estudio, utilizamos la metodología experimental de superficie de diseño-respuesta de Box-Behnken para optimizar los parámetros clave de la tecnología de procesamiento mediante la evaluación del contenido de múltiples componentes. Los resultados mostraron que la tecnología óptima de procesamiento de aceite de cordero de EF era la siguiente: calentar el aceite de cordero a 120 °C ± 10 °C, agregar el EF crudo, freírlo suavemente a 189 °C ± 10 °C hasta que esté uniformemente brillante, y luego retirarlo y enfriarlo. Por cada 100 kg de EF, se deben usar 15 kg de aceite de cordero. Las toxicidades y teratogenicidades de un extracto acuoso de EF cruda y procesada con aceite de cordero se compararon en un modelo de desarrollo de embriones de pez cebra. Los resultados mostraron que el grupo de hierbas crudas tenía más probabilidades de causar deformidades de pez cebra, y su concentración de EF letal media máxima era menor. En conclusión, la tecnología optimizada de procesamiento de aceite de cordero fue estable y confiable, con buena repetibilidad. A una cierta dosis, el extracto acuoso de EF fue tóxico para el desarrollo de embriones de pez cebra, y la toxicidad fue más fuerte para el medicamento crudo que para el medicamento procesado. Los resultados mostraron que el procesamiento del aceite de cordero redujo la toxicidad de la FE cruda. Estos hallazgos se pueden utilizar para mejorar la calidad, la uniformidad y la seguridad clínica de la FE procesada con aceite de cordero.

Introducción

Epimedii folium (EF) son las hojas secas de Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., o Epimedium koreanum Nakai. La FE se puede utilizar para tratar la osteoporosis, el síndrome menopáusico, los bultos en los senos, la hipertensión, la enfermedad coronaria y otras enfermedades1. Como medicina tradicional china (MTC), EF tiene una historia en medicina y alimentos de más de 2.000 años. Debido a su bajo precio y notable efecto de tonificación de los riñones, es ampliamente utilizado en medicamentos y alimentos saludables. EF se procesa salteándolo con aceite de cordero, un proceso descrito por primera vez en la Teoría de procesamiento de Lei Gong escrita por Lei Xiao en el períodoLiu Song 2. Las eficacias del EF crudo y el EF salteado son bastante diferentes. La EF cruda disipa principalmente el reumatismo, mientras que la EF salteada calienta los riñones para reforzar el yang3. En la actualidad, la FE es ampliamente utilizada como materia prima en medicamentos y alimentos saludables; hay 399 medicamentos chinos patentados listados, nueve alimentos saludables importados y 455 alimentos saludables domésticos con FE como materia prima4. Este material medicinal tiene grandes perspectivas de aplicación. Sin embargo, en los últimos años, ha habido cada vez más informes de reacciones adversas y lesiones hepáticas humanas causadas por alimentos saludables y medicamentos chinos patentados que utilizan FE como materia prima, y los estudios de toxicidad relacionados 5,6,7 han informado que la HA como materia prima tiene riesgos potenciales para la seguridad.

El procesamiento medicinal chino se refiere a las técnicas farmacéuticas que pueden reducir o eliminar eficazmente la toxicidad y mejorar la seguridad de las MTC. El método de procesamiento tradicional de EF es freír con aceite de cordero, lo que reduce la toxicidad de EF y mejora su efecto de calentamiento de los riñones y promoción de yang8. Este método de procesamiento está incluido en la Farmacopea China y en varias especificaciones de procesamiento1. El proceso de EF solo se especifica de la siguiente manera: por cada 100 kg de EF, se agregan 20 kg de aceite amniótico (refinado), y se cuece suavemente hasta que sea uniforme y brillante1. No hay parámetros estrictos del método de procesamiento EF en los estándares anteriores, por lo que las especificaciones de procesamiento local no se han unificado para proporcionar coherencia. Por lo tanto, sería útil realizar un estudio sistemático del proceso de FE. En este artículo, se utilizó el método experimental de superficie de diseño-respuesta de Box-Behnken para optimizar la tecnología de procesamiento de EF.

El diseño experimental de Box-Behnken es un método típicamente utilizado para optimizar los factores en un proceso. Los parámetros de extracción se pueden optimizar estableciendo la relación funcional entre los factores de ajuste de la ecuación de regresión múltiple y los valores del efecto. Recientemente, este método ha sido ampliamente utilizado para estudiar la extracción de MTC 5,6,7 y el procesamiento 9,10,11. Varios estudios han reportado métodos de preparación de la MTC que involucran el procesamiento de sal, el procesamiento del vino y la fritura siguiendo un diseño de Box-Behnken, como para Psoraleae fructus12 procesado con sal, Cnidii fructus13 procesado con vino y Cinnamomi ramulus14 tostado. Este método ha reducido el tiempo de prueba, alta precisión de prueba y es adecuado para pruebas multifactor y multinivel. El método es más simple que el método de prueba de diseño ortogonal y más completo que el método de diseño uniforme15. Las relaciones obtenidas pueden determinar el valor predicho de cualquier punto de prueba dentro del rango de prueba, lo cual es una gran ventaja. Se puede usar un modelo de pez cebra para probar si la EF es menos tóxica después del procesamiento.

En los estudios de toxicidad de la MTC, el modelo del pez cebra tiene la doble ventaja del alto rendimiento de los experimentos celulares y las similitudes con los experimentos con roedores16. Este modelo se caracteriza por su pequeño tamaño, alta tasa de desove, ciclo de reproducción corto y facilidad de reproducción. El modelo se puede utilizar en experimentos sincrónicos a gran escala en placas de cultivo celular, y la dosis del fármaco experimental es pequeña, el ciclo experimental es corto, el costo es bajo y todo el proceso experimental es fácil de observar y operar17. Los embriones de pez cebra son transparentes y se desarrollan rápidamente. Por lo tanto, la toxicidad y los efectos teratogénicos de los fármacos sobre los tejidos viscerales en diferentes etapas del desarrollo pueden ser observados directamente bajo un microscopio18. La homología genética entre el pez cebra y los humanos es tan alta como 85%18. La vía de transducción de señales del pez cebra es similar a la de los humanos18. La estructura biológica y la función fisiológica del pez cebra son muy similares a las de los mamíferos18. Por lo tanto, un modelo de pez cebra para pruebas de drogas puede proporcionar animales experimentales que son confiables y totalmente aplicables a los humanos19.

En este estudio, utilizamos la metodología de superficie de diseño-respuesta de Box-Behnken para optimizar la cantidad y temperatura del aceite de cordero y la temperatura de fritura utilizada en la tecnología de procesamiento EF, con los contenidos de icariina, epimedina A, epimedina B, epimedina C y baohuósido I como índices de evaluación. El modelo de pez cebra se utilizó para explorar preliminarmente el efecto de un extracto de agua EF en el desarrollo embrionario del pez cebra antes y después del procesamiento para evaluar el efecto de atenuación del procesamiento en la FE.

Protocolo

Todos los experimentos relacionados con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Experimentos del Instituto de MTC de Chongqing (número de certificado de revisión ética de animales de laboratorio: ZJS2022-03).

1. Determinación de los componentes bioactivos

NOTA: La especie utilizada en esta investigación fue Epimedium sagittatum, y las muestras se recolectaron en el condado de Fengdu, Chongqing. La muestra fue identificada como una parte seca sobre el suelo de E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Máxima. por investigadores del Instituto de Medicina Biológica del Instituto de Medicina Tradicional China de Chongqing.

  1. Preparar la solución del producto de control pesando con precisión la cantidad adecuada de cada sustancia de referencia, a saber, icariina, epimedina A (EA), epimedina B (EB), epimedina C (EC) y baohuósido I (BI), utilizando una balanza analítica electrónica, y disolver en metanol. Usando estos, prepare una solución madre de referencia mixta que contenga 381.61 μg/mL de icariina, 124.14 μg/mL EA, 110.24 μg/mL EB, 1091.75 μg/mL EC y 184.98 μg/mL BI.
  2. Prepare la solución del producto de prueba triturando EF a través de un tamiz No. 3. Introducir aproximadamente 0,2 g (utilizando una balanza analítica electrónica) de EF triturado en un erlenmeyer tapado, añadir 20 ml de etanol diluido y, a continuación, ultrasonicar a 400 W de potencia y frecuencia de 50 kHz durante 1 h. Agitar bien y pasar a través de un filtro de membrana de 0,22 μm para obtener la solución de prueba.
  3. Realice la cromatografía de la siguiente manera. Utilice cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una columna C18 con dimensiones de 4,6 mm x 250 mm y un diámetro interior de 5 μm. Utilice acetonitrilo como fase móvil A y agua ultrapura como fase móvil B. Utilice los siguientes parámetros de elución de gradiente: 0-30 min, 24% A a 26% A; 30-31 min, 26% A a 45% A; 31-45 min, 45% A a 47% A. Utilice una longitud de onda de detección de 220 nm (para el detector utilizado, consulte la Tabla de materiales). Mantener la temperatura de la columna a 30 °C y la velocidad actual a 1,0 ml/min, y utilizar un tamaño de muestra de 10 μL.
  4. Para investigar la relación lineal, use la solución de referencia mixta como en el paso 1.1 diluida 2 veces, 4 veces, 8 veces, 16 veces y 32 veces, para icariina, EA, EB, EC y BI, respectivamente. Utilice acetonitrilo como fase móvil A y agua ultrapura como fase móvil B.
  5. Utilice los siguientes parámetros de elución de gradiente: 0-30 min, 24% A a 26% A; 30-31 min, 26% A a 45% A; 31-45 min, 45% A a 47% A. Utilice una longitud de onda de detección de 220 nm (para el detector utilizado, consulte la Tabla de materiales). Mantener la temperatura de la columna a 30 °C y la velocidad actual a 1,0 ml/min y utilizar un tamaño de muestra de 10 μL. Finalmente, registre las áreas pico. Trazar la regresión lineal con la concentración de referencia (eje x, μg/mL) como abscisa y el área del pico (eje y) como ordenada utilizando un software profesional (ver Tabla de materiales).
  6. Realizar el ensayo de precisión midiendo la solución de control mixto seis veces consecutivas por HPLC utilizando las condiciones cromatográficas mostradas en el paso 1.3. Registre el tiempo de detección y las áreas pico de cada composición química, y calcule las desviaciones estándar relativas (RSD) de las áreas pico para evaluar la precisión (reproducibilidad) utilizando la siguiente fórmula:
    RSD% = desviación típica (DE)/media aritmética de los resultados calculados (X) x 100 %
  7. Para realizar la prueba de reproducibilidad, pesar con precisión el polvo EF y preparar seis partes de la solución del producto de ensayo en paralelo de acuerdo con el método del paso 1.2. Someter las soluciones preparadas a HPLC bajo las condiciones cromatográficas presentadas en el paso 1.3. Registre los tiempos de retención y las áreas pico de cada composición química y calcule las cantidades de cada compuesto a partir de una curva estándar (áreas pico versus concentraciones). Calcule el RSD% como se indica arriba.
  8. Para realizar la prueba de estabilidad, almacenar las soluciones de ensayo a temperatura ambiente y medir su contenido mediante el método de HPLC descrito en el paso 1.3 a las 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h y 24 h después de la preparación para evaluar la estabilidad. Registre los tiempos de retención y las áreas pico de cada composición química y calcule el porcentaje RSD de las áreas pico como se indica anteriormente.
  9. Para realizar el ensayo de recuperación de muestras, pesar 0,2 g de polvo EF en un erlenmeyer tapado durante seis réplicas. Añadir una cantidad adecuada de la solución de referencia (la cantidad de sustancia de referencia añadida a la muestra es equivalente al 100 % del contenido conocido de la muestra) y preparar la solución problema con arreglo al método presentado en la etapa 1.2.
  10. Inyectar las muestras en el cromatógrafo y analizar de acuerdo con las condiciones cromatográficas del paso 1.3. Registre las áreas pico y calcule los valores promedio de recuperación y RSD % de la siguiente manera:
    Tasa de recuperación de muestras con picos = (contenido de muestra con picos - contenido de muestra)/cantidad de muestra x 100%

2. Optimización de la tecnología de procesamiento de aceite de cordero EF utilizando la metodología de superficie de diseño-respuesta de Box-Behnken

  1. Seleccione los parámetros clave en el procesamiento de EF, como la cantidad de aceite de cordero (A; 15% -35%), la temperatura del aceite de cordero (B; 50-120 ° C) y la temperatura de fritura (C; 80-300 ° C), como factores influyentes. Utilice los puntajes completos de contenido de icariin, EA, EB, EC y BI como índices de evaluación. El porcentaje de aceite de cordero aquí es el porcentaje de masa.
  2. Utilice el software de análisis de superficie de respuesta (consulte la Tabla de materiales) para diseñar los experimentos de superficie de respuesta de Box-Behnken, explore la superficie de respuesta cuadrática y construya un modelo polinómico de segundo orden. Seleccione el nuevo diseño Box-Behnken y establezca la opción Factores numéricos en 3; establezca los factores A, B y C. Haga clic en Continuar. Establezca la opción Respuestas en 1 (que fue la puntuación completa). Haga clic en Continuar para completar el diseño. Se planificaron un total de 17 experimentos (ver Tabla 1).
    NOTA: Para las variables independientes y dependientes, junto con sus niveles bajo, medio y alto, ver Tabla 2.
  3. Procesar la FE de acuerdo con los parámetros específicos de la Tabla 1; por ejemplo, para el número de orden 1, pese el aceite de cordero refinado como 15% v / v, y luego caliente a 50 ° C para derretirlo. Añadir el EF crudo al cordero derretido, saltear a fuego suave (190 °C) hasta que esté uniformemente brillante, y luego retirar y enfriar. Realizó 17 operaciones experimentales. En este trabajo se obtuvieron un total de 17 grupos de productos procesados con EF.
    NOTA: El aceite de cordero es sólido a temperatura ambiente (25 °C) y se funde en líquido cuando se calienta. El aceite de cordero en estado líquido se puede utilizar como excipiente.
  4. Preparar las soluciones de ensayo de los productos transformados según el método descrito en el paso 1.2. A continuación, analícelos mediante HPLC de acuerdo con las condiciones cromatográficas descritas en el paso 1.3. Registre los tiempos de retención y las áreas pico de cada composición química, y calcule el contenido de icariina, EA, EB, EC y BI en cada solución de prueba contra una curva estándar externa. Utilice la fórmula de cálculo de puntuación completa a continuación para calcular las puntuaciones completas de los 17 grupos experimentales:
    Puntuación completa = Z/Z máx. × 0,5 + BI/BImáx. × 0,5
    donde Z es la suma de los contenidos de icariina, EA, EB y CE; Zmax es el valor máximo de la suma de los contenidos de icariina, EA, EB y EC en los 17 grupos experimentales; BI es el contenido de BI; y BImax es el valor máximo del contenido de BI en los 17 grupos experimentales.
  5. Importe los resultados de puntuación completos de los 17 grupos de experimentos en el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales) para analizar los datos experimentales. En los elementos de evaluación, seleccione la opción de orden de proceso cuadrático y la opción de tipo de modelo polinómico.

3. Prueba del efecto del procesamiento en el desarrollo embrionario del pez cebra

  1. Preparación de muestras
    1. Triture el crudo y el EF procesado a través de un tamiz No. 3 (consulte la Tabla de materiales). A 100 g de cada muestra de EF, agregue 1,000 ml de agua ultrapura. Remoje el EF durante 0,5 h, hierva el agua dos veces durante 30 minutos cada una y luego filtre con papel de filtro.
    2. Combinar los filtrados y concentrar la muestra calentando. Añadir agua ultrapura a un volumen final de 100 ml para obtener las soluciones madre de EF procesada (PEF, 1 g/ml) y EF bruta (CEF,1 g/ml). Mida la cantidad de medicamento crudo en cada solución madre.
    3. Colocar alícuotas de 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml y 7,5 ml de soluciones madre en matraces aforados de 10 ml y, a continuación, añadir agua ultrapura al volumen para preparar las soluciones de ensayo con concentraciones de 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml y 750 mg/ml para el estudio de embriotoxicidad del pez cebra.
      NOTA: Las concentraciones de las soluciones de ensayo se prepararon remitiéndose a la bibliografía pertinente 20,21 y realizando experimentos preliminares para dar el gradiente de concentración de10 veces utilizado en toxicología normal. La MCE fue una muestra sin procesar, y la HAP fue una muestra preparada con la mejor tecnología de procesamiento descrita en la sección 2.
  2. Cría de pez cebra y tratamiento embrionario21
    1. Adapte el pez cebra de tipo salvaje (consulte la Tabla de materiales) a una temperatura controlada durante 2 días, manténgalos en un acuario de flujo continuo a pH 7.0-7.4 y aliméntelos dos veces al día.
      NOTA: La inhibición de la formación de melanina en el pez cebra se logró mediante la adición de 1-fenil-2-tiourea en una concentración de 0,003% (masa/volumen) al medio de cultivo, que mantuvo sus cuerpos transparentes para la observación morfológica.
    2. Seleccione peces cebra de tipo salvaje fértiles adultos por la noche y sepárelos usando deflectores en cajas de apareamiento. Retire los deflectores a la mañana siguiente y deje que los peces desoven durante 30 minutos. Recogió los huevos fertilizados con un gotero cada 15 min. En total, se recolectaron 520 embriones sanos de tipo salvaje. Mantener los embriones de pez cebra en una incubadora a 28,5 °C durante 24 h.
    3. Asigne aleatoriamente los embriones sanos a las 24 h después de la fertilización (hpf) a 13 grupos, y junto con un grupo control, remoje por separado en 10 ml de cada una de las siguientes soluciones en una placa de cultivo: PEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL; CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL. Trate el grupo de control en blanco con el medio como una solución. Cada grupo contenía 40 embriones en este estudio.
      NOTA: La composición media es 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 0.25 mM Na 2 HPO 4, 0.45 mM KH 2 PO 4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO 4 y 4 mM NaHCO3.
    4. Cultive el pez cebra en una incubadora de temperatura constante hasta 120 hpf. Contar el número de larvas muertas cada día, observar la morfología de los órganos principales de las larvas en cada grupo experimental bajo un microscopio estereoscópico (barra de escala = 500 μm, ver Tabla de materiales), y calcular la concentración de media muerte (CL50) del pez cebra a 72 hpf utilizando software de análisis de datos (ver Tabla de materiales).

Resultados

Resultados de la investigación metodológica
Se observó una relación lineal entre la concentración de icariina, EA, EB, EC, BI y áreas pico cromatográficas (ver Tabla 3). Los valores de RSD% (n = 6) de las áreas pico cromatográficas de icariin, EA, EB, EC y BI fueron 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% y 1,06%, respectivamente, lo que indica que la precisión de las mediciones de HPLC fue buena. Los valores de RSD% (n = 6) de los contenidos de icariin, EA, EB, EC y BI fueron 1,59%, 1,4...

Discusión

Variables independientes y determinación de sus niveles
La tecnología de procesamiento EF solo se describe en la edición 2020 de la Farmacopea China y las especificaciones locales de procesamiento de medicamentos chinos publicadas por 26 provincias, municipios y regiones autónomas de todo el país1. La descripción implica los siguientes pasos: tomar aceite de cordero y calentarlo para que se derrita, agregar trozos EF, freír a fuego lento hasta que esté uniforme y brilla...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo del Proyecto Empresarial de Investigación Científica Básica de la Academia de Medicina Tradicional China de Chongqing (Número de proyecto: jbky20200013), el Proyecto de Orientación de Incentivos al Desempeño de las Instituciones de Investigación Científica de Chongqing (Número de proyecto: cstc2021jxjl 130025), y el Proyecto de Construcción de Disciplina Clave de la Comisión Municipal de Salud de Chongqing de Procesamiento de Materia Médica China.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher197164
Baohuoside figure-materials-103 (Bfigure-materials-195 ) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20042402
Chromatographic columnWaters CorporationSymmetry C18
Design Expert softwareStat- Ease Inc., Minneapolis, MNTrial Version8.0.6.1
DetectorWaters Corporation2998
DisintegratorHefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.S-FS553
Electronic analytical balanceMettler-Toledo International Inc.MS205DU
Epimedin A (EA)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-21112118
Epimedin B (EB)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080403
Epimedin C (EC)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080310
EthanolChongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.20180801
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Waters Corporation2695
IcariinChengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.21091401
MethanolChongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.20171101
Microporous membraneTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.0.22μm
Mutton oilKuoshan Zhiniu Fresh Food Store20211106
Office Excel office softwareMicrosoftOffice Excel 2021
Pharmacopoeia sieveShaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.R40/3
Pure water machineChongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.AT Sro 10A
Qualitative filter paperShanghai Leigu Instrument Co., Ltd.18cm
StereomicroscopeCarl Zeiss, Oberkochen, GermanyStemi 2000
Ultrasonic cleanerBranson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.BUG25-12
ZebrafishChina Zebrafish Resource Center (CZRC)The AB strain

Referencias

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