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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans ce protocole, la technologie de traitement de l’huile de mouton d’Epimedii folium (EF) a été optimisée en appliquant une méthodologie expérimentale de surface de conception-réponse de Box-Behnken, et l’effet de l’EF brut et optimisé extrait à l’eau sur le développement embryonnaire du poisson zèbre a été étudié au préalable.

Résumé

En tant que médecine traditionnelle chinoise (MTC), Epimedii folium (EF) a une histoire en médecine et en alimentation vieille de > 2 000 ans. Cliniquement, EF traité avec de l’huile de mouton est souvent utilisé comme médicament. Ces dernières années, les rapports de risques pour la sécurité et de réactions indésirables des produits qui utilisent l’EF comme matière première ont progressivement augmenté. Le traitement peut améliorer efficacement la sécurité de la MTC. Selon la théorie de la MTC, le traitement de l’huile de mouton peut réduire la toxicité de l’EF et renforcer son effet tonifiant sur les reins. Cependant, il y a un manque de recherche et d’évaluation systématiques de la technologie de traitement de l’huile de mouton EF. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthodologie expérimentale de la surface de conception-réponse de Box-Behnken pour optimiser les paramètres clés de la technologie de traitement en évaluant le contenu de plusieurs composants. Les résultats ont montré que la technologie optimale de traitement de l’huile de mouton d’EF était la suivante: chauffer l’huile de mouton à 120 ° C ± 10 ° C, ajouter l’EF brut, la faire sauter doucement à 189 ° C ± 10 ° C jusqu’à ce qu’elle soit uniformément brillante, puis la retirer et la refroidir. Pour 100 kg d’EF, 15 kg d’huile de mouton doivent être utilisés. Les toxicités et les tératogénicités d’un extrait aqueux d’EF traité à l’huile brute et à l’huile de mouton ont été comparées dans un modèle de développement embryonnaire de poisson zèbre. Les résultats ont montré que le groupe des herbes brutes était plus susceptible de causer des malformations du poisson zèbre et que sa concentration d’EF létale à moitié maximale était plus faible. En conclusion, la technologie optimisée de traitement de l’huile de mouton était stable et fiable, avec une bonne répétabilité. À une certaine dose, l’extrait aqueux d’EF était toxique pour le développement des embryons de poisson zèbre, et la toxicité était plus forte pour le médicament brut que pour le médicament transformé. Les résultats ont montré que le traitement de l’huile de mouton réduisait la toxicité de l’EF brut. Ces résultats peuvent être utilisés pour améliorer la qualité, l’uniformité et la sécurité clinique de l’EF traité à l’huile de mouton.

Introduction

Epimedii folium (EF) est les feuilles séchées d’Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., ou Epimedium koreanum Nakai. EF peut être utilisé pour traiter l’ostéoporose, le syndrome ménopausique, les masses mammaires, l’hypertension, les maladies coronariennes et d’autres maladies1. En tant que médecine traditionnelle chinoise (MTC), EF a une histoire de plus de 2 000 ans dans la médecine et l’alimentation. En raison de son faible prix et de son effet remarquable de tonifier les reins, il est largement utilisé dans les médicaments et les aliments santé. L’EF est traité en le faisant sauter avec de l’huile de mouton, un processus décrit pour la première fois dans la théorie du traitement du Lei Gong écrite par Lei Xiao dans la période2 de Liu Song. Les efficacités de l’EF brut et de l’EF sauté sont très différentes. L’EF brut dissipe principalement les rhumatismes, tandis que le FE sauté réchauffe les reins pour renforcer le yang3. À l’heure actuelle, l’EF est largement utilisé comme matière première dans les médicaments et les aliments santé; il y a 399 médicaments brevetés chinois répertoriés, neuf aliments santé importés et 455 aliments santé nationaux avec EF comme matière première4. Ce médicament a de grandes perspectives d’application. Cependant, au cours des dernières années, de plus en plus de réactions indésirables et de lésions hépatiques humaines causées par des aliments santé et des médicaments brevetés chinois utilisant l’EF comme matière première, et des études de toxicité connexes 5,6,7 ont indiqué que l’EF en tant que matière première présente des risques potentiels pour la sécurité.

Le traitement médicinal chinois fait référence aux techniques pharmaceutiques qui peuvent réduire ou éliminer efficacement la toxicité et améliorer la sécurité des MTC. La méthode de traitement traditionnelle de l’EF est la friture avec de l’huile de mouton, ce qui réduit la toxicité de l’EF et renforce son effet de réchauffement des reins et de promotion du yang8. Cette méthode de traitement est incluse dans la pharmacopée chinoise et diverses spécifications de traitement1. Le procédé d’EF n’est spécifié que comme suit: pour chaque 100 kg d’EF, 20 kg d’huile amniotique (raffinée) sont ajoutés et elle est cuite doucement jusqu’à uniformité et brillante1. Il n’y a pas de paramètres stricts de méthode de traitement EF dans les normes ci-dessus, de sorte que les spécifications de traitement locales n’ont pas été unifiées pour assurer la cohérence. Par conséquent, il serait utile de mener une étude systématique du processus d’EE. Dans cet article, la méthode expérimentale de la surface de conception-réponse de Box-Behnken a été utilisée pour optimiser la technologie de traitement de l’EF.

Le plan expérimental de Box-Behnken est une méthode généralement utilisée pour optimiser les facteurs d’un processus. Les paramètres d’extraction peuvent être optimisés en établissant la relation fonctionnelle entre les facteurs d’ajustement des équations de régression multiples et les valeurs d’effet. Récemment, cette méthode a été largement utilisée pour étudier l’extractionde la MTC 5,6,7 et le traitement9,10,11. Diverses études ont rapporté des méthodes de préparation de la MTC impliquant le traitement du sel, le traitement du vin et le sauté suivant une conception Box-Behnken, telles que pour Psoraleae fructus 12 traité au sel, Cnidii fructus13 traité au vin et Cinnamomi ramulus14 torréfié. Cette méthode a réduit le temps de test, une précision de test élevée et convient aux tests multi-facteurs et multi-niveaux. La méthode est plus simple que la méthode d’essai de conception orthogonale et plus complète que la méthode de conception uniforme15. Les relations obtenues peuvent déterminer la valeur prédite de n’importe quel point de test dans la plage de test, ce qui est un grand avantage. Un modèle de poisson zèbre peut être utilisé pour tester si l’EF est moins toxique après traitement.

Dans les études de toxicité de la MTC, le modèle du poisson zèbre présente le double avantage du débit élevé des expériences cellulaires et des similitudes avec les expériences sur les rongeurs16. Ce modèle se caractérise par sa petite taille, son taux de frai élevé, son cycle de reproduction court et sa facilité de reproduction. Le modèle peut être utilisé dans des expériences synchrones à grande échelle dans des plaques de culture cellulaire, et le dosage du médicament expérimental est faible, le cycle expérimental est court, le coût est faible et l’ensemble du processus expérimental est facile à observer et à utiliser17. Les embryons de poisson zèbre sont transparents et se développent rapidement. Par conséquent, la toxicité et les effets tératogènes des médicaments sur les tissus viscéraux à différents stades de développement peuvent être directement observés au microscope18. L’homologie génétique entre le poisson zèbre et les humains atteint 85 %18. La voie de transduction du signal du poisson zèbre est similaire à celle de l’homme18. La structure biologique et la fonction physiologique du poisson zèbre sont très similaires à celles des mammifères18. Par conséquent, un modèle de poisson zèbre pour les tests de dépistage de drogues peut fournir des animaux de laboratoire fiables et pleinement applicables aux humains19.

Dans cette étude, nous avons utilisé la méthodologie de surface de conception-réponse de Box-Behnken pour optimiser la quantité et la température de l’huile de mouton et la température de friture utilisée dans la technologie de traitement EF, avec les teneurs en icariin, épimédine A, épimédine B, épimédine C et baohuoside I comme indices d’évaluation. Le modèle du poisson-zèbre a été utilisé pour explorer de manière préliminaire l’effet d’un extrait d’eau EF sur le développement embryonnaire du poisson zèbre avant et après le traitement afin d’évaluer l’effet d’atténuation du traitement sur le FE.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité d’éthique des expériences de l’Institut de MTC de Chongqing (numéro de certificat d’examen éthique des animaux de laboratoire : ZJS2022-03).

1. Détermination des composants bioactifs

NOTE: L’espèce utilisée dans cette recherche était Epimedium sagittatum, et les échantillons ont été collectés dans le comté de Fengdu, Chongqing. L’échantillon a été identifié comme une partie sèche du sol d’E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Sentence. par des chercheurs de l’Institut de médecine biologique de l’Institut de médecine traditionnelle chinoise de Chongqing.

  1. Préparer la solution du produit antiparasitaire en pesant avec précision la quantité appropriée de chaque substance de référence, à savoir l’icariine, l’épimédine A (EA), l’épimédine B (EB), l’épimédine C (EC) et le baohuoside I (BI), à l’aide d’une balance analytique électronique, et la dissoudre dans du méthanol. À l’aide de ceux-ci, préparer une solution mère de référence mélangée contenant 381,61 μg/mL d’icariin, 124,14 μg/mL d’EA, 110,24 μg/mL d’EB, 1091,75 μg/mL EC et 184,98 μg/mL de BI.
  2. Préparer la solution du produit d’essai en écrasant EF à travers un tamis no 3. Placer environ 0,2 g (à l’aide d’une balance analytique électronique) de FE broyé dans un erlenmeyer bouché, ajouter 20 mL d’éthanol dilué, puis ultrasons à une puissance de 400 W et à une fréquence de 50 kHz pendant 1 h. Bien agiter et passer à travers un filtre à membrane de 0,22 μm pour obtenir la solution d’essai.
  3. Effectuez la chromatographie comme suit. Utiliser la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) avec une colonne C18 avec des dimensions de 4,6 mm x 250 mm et un diamètre intérieur de 5 μm. Utiliser l’acétonitrile comme phase mobile A et l’eau ultrapure comme phase mobile B. Utiliser les paramètres d’élution de gradient suivants : 0-30 min, 24 % A à 26 % A; 30-31 min, 26% A à 45% A; 31-45 min, 45% A à 47% A. Utiliser une longueur d’onde de détection de 220 nm (pour le détecteur utilisé, voir Tableau des matériaux). Maintenez la température de la colonne à 30 °C et la vitesse du courant à 1,0 mL/min, et utilisez un échantillon de 10 μL.
  4. Pour étudier la relation linéaire, utilisez la solution de référence mixte comme à l’étape 1.1 diluée 2 fois, 4 fois, 8 fois, 16 fois et 32 fois, pour icariin, EA, EB, EC et BI, respectivement. Utilisez l’acétonitrile comme phase mobile A et l’eau ultrapure comme phase mobile B.
  5. Utiliser les paramètres d’élution de gradient suivants : 0-30 min, 24 % A à 26 % A; 30-31 min, 26% A à 45% A; 31-45 min, 45% A à 47% A. Utiliser une longueur d’onde de détection de 220 nm (pour le détecteur utilisé, voir Tableau des matériaux). Maintenez la température de la colonne à 30 °C et la vitesse du courant à 1,0 mL/min et utilisez un échantillon de 10 μL. Enfin, notez les zones de pointe. Tracer la régression linéaire avec la concentration de référence (axe des abscisses, μg/mL) comme abscisse et l’aire du pic (axe des y) comme ordonnée à l’aide d’un logiciel professionnel (voir le tableau des matériaux).
  6. Effectuer l’essai de précision en mesurant la solution témoin mélangée six fois consécutives par CLHP en utilisant les conditions chromatographiques indiquées à l’étape 1.3. Enregistrer le temps de détection et les zones de pic de chaque composition chimique, et calculer les écarts-types relatifs (DSR) des zones de pics pour évaluer la précision (reproductibilité) à l’aide de la formule ci-dessous:
    RSD% = écart type (ET)/moyenne arithmétique des résultats calculés (X) x 100 %
  7. Pour effectuer l’essai de reproductibilité, peser avec précision la poudre EF et préparer six parties de la solution du produit d’essai en parallèle selon la méthode décrite à l’étape 1.2. Soumettre les solutions préparées à la CLHP dans les conditions chromatographiques présentées à l’étape 1.3. Enregistrer les temps de rétention et les zones de pics de chaque composition chimique et calculer les quantités de chaque composé à partir d’une courbe standard (zones de pics par rapport aux concentrations). Calculez le RSD% comme ci-dessus.
  8. Pour effectuer l’essai de stabilité, conserver les solutions d’essai à température ambiante et mesurer leur contenu par la méthode CLHP décrite à l’étape 1.3 à 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h et 24 h après la préparation pour évaluer la stabilité. Enregistrer les temps de rétention et les zones de pic de chaque composition chimique et calculer le pourcentage RSD% des zones de pics comme ci-dessus.
  9. Pour effectuer l’essai de récupération de l’échantillon, peser 0,2 g de poudre EF dans un erlenmeyer bouché pour six répétitions. Ajouter une quantité appropriée de la solution de référence (la quantité de substance de référence ajoutée à l’échantillon équivaut à 100 % de la teneur connue de l’échantillon) et préparer la solution d’essai selon la méthode présentée à l’étape 1.2.
  10. Injecter les échantillons dans le chromatographe et analyser selon les conditions chromatographiques de l’étape 1.3. Enregistrez les zones de pointe et calculez les valeurs moyennes de récupération et de RSD% comme ci-dessous:
    Taux de récupération de l’échantillon avec pic = (contenu de l’échantillon enrichi − contenu de l’échantillon)/quantité d’échantillon x 100 %

2. Optimisation de la technologie de traitement de l’huile de mouton EF à l’aide de la méthodologie de surface de conception-réponse de Box-Behnken

  1. Sélectionnez les paramètres clés du traitement EF, tels que la quantité d’huile de mouton (A; 15%-35%), la température de l’huile de mouton (B; 50-120 °C) et la température de friture (C; 80-300 °C), comme facteurs influents. Utilisez les scores complets du contenu icariin, EA, EB, EC et BI comme indices d’évaluation. Le pourcentage d’huile de mouton ici est le pourcentage de masse.
  2. Utilisez le logiciel d’analyse de surface de réponse (voir Tableau des matériaux) pour concevoir les expériences de surface de réponse de Box-Behnken, explorer la surface de réponse quadratique et construire un modèle polynomial de second ordre. Sélectionnez le nouveau dessin Box-Behnken et définissez l’option Facteurs numériques sur 3 ; Définissez les facteurs A, B et C. Cliquez sur Continuer. Définissez l’option Réponses sur 1 (qui était le score complet). Cliquez sur Continuer pour terminer la conception. Au total, 17 expériences étaient prévues (voir tableau 1).
    REMARQUE : Pour les variables indépendantes et dépendantes, ainsi que leurs niveaux faible, moyen et élevé, voir le tableau 2.
  3. Traiter l’EE selon les paramètres spécifiques du tableau 1; par exemple, pour l’ordre numéro 1, pesez l’huile de mouton raffinée à 15 % v/v, puis chauffez-la à 50 °C pour la faire fondre. Ajouter l’EF brut au mouton fondu, faire sauter sur un feu doux (190 °C) jusqu’à ce qu’il soit uniformément brillant, puis retirer et laisser refroidir. Réalisation de 17 opérations expérimentales. Au total, 17 groupes de produits transformés par EE ont été obtenus dans le cadre de ce travail.
    NOTE: L’huile de mouton est solide à température ambiante (25 ° C) et fond en liquide lorsqu’elle est chauffée. L’huile de mouton à l’état liquide peut être utilisée comme excipient.
  4. Préparer les solutions d’essai des produits transformés selon la méthode décrite à l’étape 1.2. Ensuite, analysez-les à l’aide de la CLHP selon les conditions chromatographiques décrites à l’étape 1.3. Enregistrer les temps de rétention et les zones de pic de chaque composition chimique et calculer les teneurs en icariin, EA, EB, EC et BI dans chaque solution d’essai par rapport à une courbe étalon externe. Utilisez la formule de calcul du score complet ci-dessous pour calculer les scores complets des 17 groupes expérimentaux :
    Score complet = Z/Z max × 0,5 + BI/BImax × 0,5
    où Z est la somme des teneurs en icariin, EA, EB et EC; Zmax est la valeur maximale de la somme des teneurs en icariin, EA, EB et EC dans les 17 groupes expérimentaux; BI est le contenu BI ; et BImax est la valeur maximale de la teneur en BI dans les 17 groupes expérimentaux.
  5. Importez les résultats de notation complets pour les 17 groupes d’expériences dans le logiciel d’analyse des données (voir le tableau des matériaux) pour analyser les données expérimentales. Sous les éléments d’évaluation, sélectionnez l’option d’ordre de processus quadratique et l’option de type de modèle polynomial.

3. Tester l’effet de la transformation sur le développement embryonnaire du poisson zèbre

  1. Préparation des échantillons
    1. Broyer le brut et le FE traité à l’aide d’un tamis no 3 (voir le tableau des matériaux). À 100 g de chaque échantillon de FE, ajouter 1 000 mL d’eau ultrapure. Faire tremper l’EF pendant 0,5 h, faire bouillir l’eau deux fois pendant 30 min chacune, puis filtrer avec du papier filtre.
    2. Mélanger les filtrat et concentrer l’échantillon par chauffage. Ajouter de l’eau ultrapure à un volume final de 100 mL pour obtenir les solutions mères EF (PEF, 1 g/mL) et EF brutes (CEF, 1 g/mL). Mesurer la quantité de médicament cru dans chaque solution mère.
    3. Placer des aliquotes de 1 mL, 1,5 mL, 2,5 mL, 5 mL et 7,5 mL de solutions mères dans des fioles jaugées de 10 mL, puis ajouter de l’eau ultrapure au volume pour préparer les solutions d’essai à des concentrations de 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL et 750 mg/mL pour l’étude d’embryotoxicité du poisson zèbre.
      NOTE: Les concentrations des solutions d’essai ont été préparées en se référant à la littérature pertinente 20,21 et en effectuant des expériences préliminaires pour obtenir le gradient de concentration de10 fois utilisé en toxicologie normale. Le CEF était un échantillon non transformé, et le PEF était un échantillon préparé avec la meilleure technologie de transformation décrite à la section 2.
  2. Élevage de poissons zèbres et traitement des embryons21
    1. Adaptez le poisson-zèbre de type sauvage (voir le tableau des matériaux) à une température contrôlée pendant 2 jours, gardez-le dans un aquarium à flux continu à un pH de 7,0 à 7,4 et nourrissez-le deux fois par jour.
      NOTE: L’inhibition de la formation de mélanine chez le poisson zèbre a été obtenue en ajoutant 1-phényl-2-thiourée à une concentration de 0,003% (masse / volume) au milieu de culture, ce qui a gardé leur corps transparent pour l’observation morphologique.
    2. Sélectionnez le poisson zèbre fertile adulte de type sauvage le soir et séparez-le en utilisant des chicanes dans les boîtes d’accouplement. Retirez les chicanes le lendemain matin et laissez les poissons frayer pendant 30 minutes. Recueilli les œufs fécondés avec un compte-gouttes toutes les 15 minutes. Au total, 520 embryons sains de type sauvage ont été collectés. Conserver les embryons de poisson-zèbre dans un incubateur à 28,5 °C pendant 24 h.
    3. Assigner au hasard les embryons sains à 24 heures après la fécondation (HPF) à 13 groupes et, avec un groupe témoin, tremper séparément dans 10 mL de chacune des solutions suivantes dans une boîte de culture : EEP : 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL; CEF : 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL. Traiter le groupe témoin blanc avec le milieu comme solution. Chaque groupe contenait 40 embryons dans cette étude.
      NOTE: La composition du milieu est de 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mMNa2 HPO 4, 0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 et 4 mM NaHCO3.
    4. Cultivez le poisson zèbre dans un incubateur à température constante jusqu’à 120 hpf. Compter le nombre de larves mortes chaque jour, observer la morphologie des organes principaux des larves dans chaque groupe expérimental au stéréomicroscope (barre d’échelle = 500 μm, voir le tableau des matériaux) et calculer la concentration de demi-mort (CL50) du poisson zèbre à 72 hpf à l’aide d’un logiciel d’analyse de données (voir le tableau des matériaux).

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Résultats

Résultats de l’enquête méthodologique
Une relation linéaire entre la concentration d’icariin, EA, EB, EC, BI et les zones de pics chromatographiques a été observée (voir le tableau 3). Les valeurs RSD% (n = 6) des zones de pics chromatographiques de l’icariin, EA, EB, EC et BI étaient respectivement de 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% et 1,06%, ce qui indique que la précision des mesures HPLC était bonne. Les valeurs RSD% (n = 6) des teneurs en icariin, EA, EB, EC et BI éta...

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Discussion

Variables indépendantes et détermination de leurs niveaux
La technologie de traitement EF n’est décrite que dans l’édition 2020 de la pharmacopée chinoise et les spécifications de traitement de la médecine chinoise locale publiées par 26 provinces, municipalités et régions autonomes à travers le pays1. La description comprend les étapes suivantes: prendre de l’huile de mouton et la chauffer pour la faire fondre, ajouter des lambeaux EF, faire sauter à feu len...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le projet commercial de recherche scientifique fondamentale de l’Académie de médecine traditionnelle chinoise de Chongqing (numéro de projet: jbky20200013), le projet d’orientation des incitations à la performance des institutions de recherche scientifique de Chongqing (numéro de projet: cstc2021jxjl 130025) et le projet de construction de disciplines clés de la Commission municipale de santé de Chongqing de Chinese Materia Medica Processing.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher197164
Baohuoside figure-materials-103 (Bfigure-materials-195 ) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20042402
Chromatographic columnWaters CorporationSymmetry C18
Design Expert softwareStat- Ease Inc., Minneapolis, MNTrial Version8.0.6.1
DetectorWaters Corporation2998
DisintegratorHefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.S-FS553
Electronic analytical balanceMettler-Toledo International Inc.MS205DU
Epimedin A (EA)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-21112118
Epimedin B (EB)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080403
Epimedin C (EC)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080310
EthanolChongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.20180801
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Waters Corporation2695
IcariinChengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.21091401
MethanolChongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.20171101
Microporous membraneTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.0.22μm
Mutton oilKuoshan Zhiniu Fresh Food Store20211106
Office Excel office softwareMicrosoftOffice Excel 2021
Pharmacopoeia sieveShaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.R40/3
Pure water machineChongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.AT Sro 10A
Qualitative filter paperShanghai Leigu Instrument Co., Ltd.18cm
StereomicroscopeCarl Zeiss, Oberkochen, GermanyStemi 2000
Ultrasonic cleanerBranson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.BUG25-12
ZebrafishChina Zebrafish Resource Center (CZRC)The AB strain

Références

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