A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
בפרוטוקול זה, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש של Epimedii folium (EF) עברה אופטימיזציה על ידי יישום מתודולוגיית תכנון-תגובה ניסיונית של Box-Behnken, וההשפעה של EF גולמי וממוטב המופק במים על התפתחות עוברית של דגי זברה נחקרה באופן ראשוני.
כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל- Epimedii folium (EF) יש היסטוריה ברפואה ובמזון בת > 2,000 שנה. מבחינה קלינית, EF מעובד עם שמן כבש משמש לעתים קרובות כתרופה. בשנים האחרונות התרבו בהדרגה הדיווחים על סיכוני בטיחות ותגובות שליליות של מוצרים המשתמשים ב-EF כחומר גלם. עיבוד יכול לשפר ביעילות את הבטיחות של TCM. על פי תיאוריית TCM, עיבוד שמן כבש יכול להפחית את הרעילות של EF ולשפר את ההשפעה המחזקת שלו על הכליות. עם זאת, קיים מחסור במחקר שיטתי והערכה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF. במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken כדי למטב את הפרמטרים העיקריים של טכנולוגיית העיבוד על ידי הערכת התוכן של רכיבים מרובים. התוצאות הראו כי הטכנולוגיה האופטימלית לעיבוד שמן כבש של EF הייתה כדלקמן: חימום שמן הכבש ב 120 ° C ± 10 ° C, הוספת EF גולמי, מוקפץ אותו בעדינות ל 189 ° C ± 10 ° C עד שהוא מבריק באופן שווה, ולאחר מכן להסיר אותו מגניב. על כל 100 ק"ג של EF, יש להשתמש ב-15 ק"ג שמן כבש. הרעילות והטרטוגניות של תמצית מימית של EF מעובד של שמן גולמי ושמן כבש הושוו במודל התפתחותי של עוברים של דגי זברה. התוצאות הראו כי קבוצת העשבים הגולמי הייתה בעלת סיכוי גבוה יותר לגרום לעיוותים בדגי זברה, וריכוז ה-EF הקטלני החצי מקסימלי שלה היה נמוך יותר. לסיכום, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש האופטימלית הייתה יציבה ואמינה, עם חזרתיות טובה. במינון מסוים, התמצית המימית של EF הייתה רעילה להתפתחות עוברים של דגי זברה, והרעילות הייתה חזקה יותר עבור התרופה הגולמית מאשר עבור התרופה המעובדת. התוצאות הראו כי עיבוד שמן כבש הפחית את הרעילות של EF גולמי. ממצאים אלה יכולים לשמש לשיפור האיכות, האחידות והבטיחות הקלינית של EF מעובד בשמן כבש.
Epimedii folium (EF) הוא העלים המיובשים של Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., או Epimedium koreanum Nakai. EF יכול לשמש לטיפול אוסטאופורוזיס, תסמונת גיל המעבר, גושים בשד, יתר לחץ דם, מחלת לב כלילית, ומחלות אחרות1. כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל-EF יש היסטוריה ברפואה ובמזון של יותר מ-2,000 שנה. בשל מחירו הנמוך והשפעתו יוצאת הדופן של חיטוב הכליות, הוא נמצא בשימוש נרחב בתרופות ובמזון בריאות. EF מעובד על ידי הקפצה עם שמן כבש, תהליך שתואר לראשונה בתורת עיבוד ליי גונג שנכתבה על ידי ליי שיאו בתקופת ליו סונג2. היעילות של EF גולמי ו-EF מוקפץ שונה לגמרי. EF גולמי בעיקר מפיג שיגרון, בעוד EF מוקפץ מחמם את הכליות כדי לחזק יאנג3. כיום, EF נמצא בשימוש נרחב כחומר גלם בתרופות ומזון בריאות; ישנם 399 תרופות פטנט סיניות רשומות, תשעה מזונות בריאות מיובאים, ו 455 מזונות בריאות מקומיים עם EF כחומר גלם4. חומר מרפא זה יש לקוחות פוטנציאליים יישום גדול. עם זאת, בשנים האחרונות התרבו הדיווחים על תופעות לוואי ופגיעה בכבד האנושי שנגרמו על ידי מזון בריאות ותרופות פטנט סיניות המשתמשות ב-EF כחומר גלם, ומחקרי רעילות קשורים 5,6,7 דיווחו כי ל-EF כחומר גלם יש סיכוני בטיחות פוטנציאליים.
עיבוד רפואי סיני מתייחס לטכניקות פרמצבטיות שיכולות להפחית או לחסל ביעילות את הרעילות ולשפר את הבטיחות של TCMs. שיטת העיבוד המסורתית של EF היא הקפצה עם שמן כבש, אשר מפחית את הרעילות של EF ומגביר את השפעתו של חימום הכליות וקידום יאנג8. שיטת עיבוד זו כלולה בפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד שונים1. התהליך של EF מוגדר רק כדלקמן: על כל 100 ק"ג של EF, 20 ק"ג שמן שפיר (מזוקק) מתווסף, והוא נורה בעדינות עד אחיד ומבריק1. אין פרמטרים קפדניים של שיטת עיבוד EF בתקנים לעיל, ולכן מפרטי עיבוד מקומיים לא אוחדו כדי לספק עקביות. לכן, זה יהיה שימושי לנהל מחקר שיטתי של תהליך EF. במאמר זה, שיטת משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken שימשה לאופטימיזציה של טכנולוגיית העיבוד של EF.
התכנון הניסיוני של Box-Behnken הוא שיטה המשמשת בדרך כלל לאופטימיזציה של הגורמים בתהליך. ניתן למטב את פרמטרי החילוץ על ידי קביעת הקשר הפונקציונלי בין גורמים המתאימים למשוואות רגרסיה מרובות לבין ערכי אפקט. לאחרונה, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקר מיצוי TCM 5,6,7 ועיבוד 9,10,11. מחקרים שונים דיווחו על שיטות הכנת TCM הכוללות עיבוד מלח, עיבוד יין והקפצה בעקבות עיצוב Box-Behnken, כגון Psoraleae fructus 12 מעובד במלח, Cnidii fructus13 מעובד יין, ו Cinnamomi ramulus14 קלוי. שיטה זו צמצמה את זמן הבדיקה, דיוק בדיקה גבוה, והיא מתאימה לבדיקות מרובות גורמים ורב-שכבתיים. השיטה פשוטה יותר משיטת בדיקת התכנון האורתוגונלי ומקיפה יותר משיטת התכנון האחיד15. הקשרים המתקבלים יכולים לקבוע את הערך החזוי של כל נקודת בדיקה בטווח הבדיקה, וזה יתרון גדול. מודל דג זברה יכול לשמש כדי לבדוק אם EF הוא פחות רעיל לאחר עיבוד.
במחקרי רעילות TCM, למודל דגי הזברה יש את היתרונות הכפולים של התפוקה הגבוהה של ניסויים בתאים ואת הדמיון לניסויים במכרסמים16. מודל זה מאופיין בגודלו הקטן, קצב השרצה גבוה, מחזור רבייה קצר וקלות הרבייה. ניתן להשתמש במודל בניסויים סינכרוניים בקנה מידה גדול בצלחות תרבית תאים, ומינון התרופה הניסיונית קטן, מחזור הניסוי קצר, העלות נמוכה, וכל תהליך הניסוי קל לצפייה ולתפעול17. עוברי דגי זברה הם שקופים ומתפתחים במהירות. לכן, את הרעילות ואת ההשפעות הטרטוגניות של תרופות על רקמות הקרביים בשלבים התפתחותיים שונים ניתן לראות ישירות תחת מיקרוסקופ18. ההומולוגיה הגנטית בין דגי זברה לבני אדם היא גבוהה עד 85%18. מסלול העברת האותות של דגי זברה דומה לזה של בני אדם18. המבנה הביולוגי והתפקוד הפיזיולוגי של דגי הזברה דומים מאוד לאלה של יונקים18. לכן, מודל דגי זברה לבדיקות סמים יכול לספק חיות ניסוי אמינות וישימות באופן מלא לבני אדם19.
במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken כדי למטב את הכמות והטמפרטורה של שמן כבש ואת טמפרטורת הטיגון המשמשת בטכנולוגיית עיבוד EF, עם התוכן של icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C ו- baohuoside I כמדדי הערכה. מודל דגי הזברה שימש לחקירה ראשונית של ההשפעה של תמצית מים EF על התפתחות עוברית של דגי זברה לפני ואחרי עיבוד כדי להעריך את השפעת ההנחתה של העיבוד על EF.
כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים נערכו באישור ועדת האתיקה של הניסויים של מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית (מספר תעודת סקירת אתיקה של חיות מעבדה: ZJS2022-03).
1. קביעת המרכיבים הביו-אקטיביים
הערה: המין ששימש במחקר זה היה Epimedium sagittatum, והדגימות נאספו במחוז פנגדו, צ'ונגצ'ינג. הדגימה זוהתה כחלק יבש מעל פני הקרקע של E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) מקסים. על ידי חוקרי המכון לרפואה ביולוגית, מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית.
2. אופטימיזציה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF באמצעות מתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken
3. בדיקת השפעת העיבוד על התפתחות עוברית של דגי זברה
תוצאות חקירה מתודולוגית
נצפה קשר ליניארי בין ריכוז איקרין, EA, EB, EC, BI ואזורי שיא כרומטוגרפיים (ראה טבלה 3). ערכי ה-RSD% (n = 6) של אזורי השיא הכרומטוגרפיים של icariin, EA, EB, EC ו-BI היו 0.28%, 1.22%, 0.65%, 1.67% ו-1.06%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שהדיוק של מדידות HPLC היה טוב. ערכי RSD% (n = 6) של התוכן של icariin, EA,...
משתנים בלתי תלויים וקביעת רמתם
טכנולוגיית עיבוד EF מתוארת רק במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד הרפואה הסינית המקומיים שפורסמו על ידי 26 מחוזות, עיריות ואזורים אוטונומיים ברחבי המדינה1. התיאור כולל את השלבים הבאים: לקיחת שמן כבש וחימום להמסתו, הוספת שברי E...
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר המדעי הבסיסי של האקדמיה לרפואה סינית מסורתית של צ'ונגצ'ינג (מספר פרויקט: jbky20200013), פרויקט הנחיית תמריץ ביצועים של מוסדות המחקר המדעי של צ'ונגצ'ינג (מספר פרויקט: cstc2021jxjl 130025), ופרויקט בניית משמעת מפתח של ועדת הבריאות העירונית של צ'ונגצ'ינג של עיבוד Materia Medica הסיני.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside ![]() ![]() | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
Detector | Waters Corporation | 2998 | |
Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved