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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo protocollo, la tecnologia di lavorazione dell'olio di montone di Epimedii folium (EF) è stata ottimizzata applicando una metodologia sperimentale di superficie di progettazione-risposta Box-Behnken ed è stato studiato preliminarmente l'effetto dell'EF grezzo e ottimizzato estratto dall'acqua sullo sviluppo embrionale del pesce zebra.

Abstract

Come medicina tradizionale cinese (MTC), Epimedii folium (EF) ha una storia in medicina e cibo che ha > 2.000 anni. Clinicamente, l'EF elaborato con olio di montone è spesso usato come medicinale. Negli ultimi anni, le segnalazioni di rischi per la sicurezza e reazioni avverse di prodotti che utilizzano EF come materia prima sono gradualmente aumentate. L'elaborazione può migliorare efficacemente la sicurezza della MTC. Secondo la teoria TCM, la lavorazione dell'olio di montone può ridurre la tossicità dell'EF e migliorare il suo effetto tonificante sui reni. Tuttavia, mancano ricerche e valutazioni sistematiche della tecnologia di trattamento dell'olio di montone EF. In questo studio, abbiamo utilizzato la metodologia sperimentale della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken per ottimizzare i parametri chiave della tecnologia di lavorazione valutando il contenuto di più componenti. I risultati hanno mostrato che la tecnologia ottimale di lavorazione dell'olio di montone di EF era la seguente: riscaldare l'olio di montone a 120 °C ± 10 °C, aggiungere l'EF grezzo, saltarlo delicatamente a 189 °C ± 10 °C fino a quando non è uniformemente lucido, quindi rimuoverlo e raffreddarlo. Per ogni 100 kg di EF, devono essere utilizzati 15 kg di olio di montone. Le tossicità e le teratogenicità di un estratto acquoso di EF grezzo e olio di montone sono state confrontate in un modello di sviluppo dell'embrione di zebrafish. I risultati hanno mostrato che il gruppo di erbe grezze aveva maggiori probabilità di causare deformità del pesce zebra e la sua concentrazione EF letale semi-massima era inferiore. In conclusione, la tecnologia ottimizzata di lavorazione dell'olio di montone era stabile e affidabile, con una buona ripetibilità. Ad una certa dose, l'estratto acquoso di EF era tossico per lo sviluppo di embrioni di zebrafish e la tossicità era più forte per il farmaco grezzo che per il farmaco trasformato. I risultati hanno mostrato che la lavorazione dell'olio di montone ha ridotto la tossicità dell'EF grezzo. Questi risultati possono essere utilizzati per migliorare la qualità, l'uniformità e la sicurezza clinica dell'EF trattato con olio di montone.

Introduzione

Epimedii folium (EF) è le foglie essiccate di Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., o Epimedium koreanum Nakai. EF può essere usato per trattare l'osteoporosi, la sindrome della menopausa, noduli al seno, ipertensione, malattia coronarica e altre malattie1. Come medicina tradizionale cinese (MTC), EF ha una storia in medicina e cibo di oltre 2.000 anni. Grazie al suo basso prezzo e al notevole effetto di tonificare i reni, è ampiamente usato in medicinali e alimenti salutari. L'EF viene lavorato saltando in padella con olio di montone, un processo descritto per la prima volta nella teoria dell'elaborazione del Lei Gong scritta da Lei Xiao nel periodo Liu Song2. L'efficacia dell'EF grezzo e dell'EF saltato in padella è molto diversa. L'EF grezzo dissipa principalmente i reumatismi, mentre l'EF saltato in padella riscalda i reni per rinforzare lo yang3. Allo stato attuale, l'EF è ampiamente utilizzato come materia prima nei farmaci e negli alimenti salutari; ci sono 399 farmaci brevettati cinesi elencati, nove alimenti salutari importati e 455 alimenti salutari domestici con EF come materia prima4. Questo medicinale ha grandi prospettive di applicazione. Tuttavia, negli ultimi anni, ci sono state crescenti segnalazioni di reazioni avverse e lesioni epatiche umane causate da alimenti salutari e medicinali brevettati cinesi che utilizzano EF come materia prima, e i relativi studi di tossicità 5,6,7 hanno riferito che l'EF come materia prima ha potenziali rischi per la sicurezza.

L'elaborazione medicinale cinese si riferisce a tecniche farmaceutiche che possono ridurre o eliminare efficacemente la tossicità e migliorare la sicurezza delle MTC. Il metodo di lavorazione tradizionale di EF è la frittura in padella con olio di montone, che riduce la tossicità dell'EF e migliora il suo effetto di riscaldamento dei reni e promozione dello yang8. Questo metodo di lavorazione è incluso nella farmacopea cinese e varie specifiche di lavorazione1. Il processo di EF è specificato solo come segue: per ogni 100 kg di EF, vengono aggiunti 20 kg di olio amniotico (raffinato) e viene cotto in modo delicato fino a quando uniforme e lucido1. Non ci sono parametri rigorosi del metodo di elaborazione EF negli standard di cui sopra, quindi le specifiche di elaborazione locali non sono state unificate per garantire la coerenza. Pertanto, sarebbe utile condurre uno studio sistematico del processo di impronta ambientale. In questo articolo, il metodo sperimentale Box-Behnken della superficie di progettazione-risposta è stato utilizzato per ottimizzare la tecnologia di elaborazione di EF.

Il progetto sperimentale Box-Behnken è un metodo tipicamente utilizzato per ottimizzare i fattori in un processo. I parametri di estrazione possono essere ottimizzati stabilendo la relazione funzionale tra più fattori di adattamento delle equazioni di regressione e valori di effetto. Recentemente, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare l'estrazione TCM 5,6,7 e l'elaborazione 9,10,11. Vari studi hanno riportato metodi di preparazione TCM che coinvolgono la lavorazione del sale, la lavorazione del vino e la frittura in padella seguendo un design Box-Behnken, come per Psoraleae fructus 12 trattato con sale, Cnidii fructus13 lavorato con vino e Cinnamomi ramulus14 arrostito. Questo metodo ha ridotto i tempi di test, un'elevata precisione del test ed è adatto per test multifattoriali e multilivello. Il metodo è più semplice del metodo di prova di progettazione ortogonale e più completo del metodo di progettazione uniforme15. Le relazioni ottenute possono determinare il valore previsto di qualsiasi punto di test all'interno dell'intervallo di test, il che rappresenta un grande vantaggio. Un modello di zebrafish può essere utilizzato per verificare se l'EF è meno tossico dopo la lavorazione.

Negli studi di tossicità TCM, il modello zebrafish presenta il duplice vantaggio dell'elevata produttività degli esperimenti sulle cellule e delle somiglianze con gli esperimenti sui roditori16. Questo modello è caratterizzato da piccole dimensioni, alto tasso di deposizione delle uova, breve ciclo di riproduzione e facilità di allevamento. Il modello può essere utilizzato in esperimenti sincroni su larga scala in piastre di coltura cellulare e il dosaggio del farmaco sperimentale è piccolo, il ciclo sperimentale è breve, il costo è basso e l'intero processo sperimentale è facile da osservare e utilizzare17. Gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e si sviluppano rapidamente. Pertanto, la tossicità e gli effetti teratogeni dei farmaci sui tessuti viscerali in diversi stadi di sviluppo possono essere osservati direttamente al microscopio18. L'omologia genica tra zebrafish e umani raggiunge l'85%18. La via di trasduzione del segnale del pesce zebra è simile a quella degli esseri umani18. La struttura biologica e la funzione fisiologica del pesce zebra sono molto simili a quelle dei mammiferi18. Pertanto, un modello di zebrafish per test antidroga può fornire animali da esperimento affidabili e pienamente applicabili agli esseri umani19.

In questo studio, abbiamo utilizzato la metodologia della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken per ottimizzare la quantità e la temperatura dell'olio di montone e la temperatura di frittura utilizzata nella tecnologia di lavorazione EF, con i contenuti di icariina, epimedina A, epimedina B, epimedina C e baohuoside I come indici di valutazione. Il modello di zebrafish è stato utilizzato per esplorare preliminarmente l'effetto di un estratto di acqua EF sullo sviluppo embrionale del pesce zebra prima e dopo la lavorazione per valutare l'effetto di attenuazione della lavorazione sull'EF.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti relativi agli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato etico degli esperimenti dell'Istituto di MTC di Chongqing (numero di certificato di revisione etica degli animali da laboratorio: ZJS2022-03).

1. Determinazione dei componenti bioattivi

NOTA: La specie utilizzata in questa ricerca era Epimedium sagittatum, e i campioni sono stati raccolti nella contea di Fengdu, Chongqing. Il campione è stato identificato come una parte secca fuori terra di E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Massima. dai ricercatori dell'Istituto di Medicina Biologica, Istituto di Medicina Tradizionale Cinese di Chongqing.

  1. Preparare la soluzione del prodotto di controllo pesando accuratamente la quantità appropriata di ciascuna sostanza di riferimento, vale a dire icariina, epimedina A (EA), epimedina B (EB), epimedina C (EC) e baohuoside I (BI), utilizzando una bilancia analitica elettronica, e sciogliere in metanolo. Utilizzandoli, preparare una soluzione madre di riferimento mista contenente 381,61 μg/mL icariina, 124,14 μg/mL EA, 110,24 μg/mL EB, 1091,75 μg/mL EC e 184,98 μg/mL BI.
  2. Preparare la soluzione del prodotto di prova schiacciando EF attraverso un setaccio n. 3. Introdurre circa 0,2 g (utilizzando una bilancia analitica elettronica) di EF frantumato in un matraccio Erlenmeyer tappato, aggiungere 20 ml di etanolo diluito e quindi ultrasonicare a 400 W di potenza e frequenza di 50 kHz per 1 ora. Agitare bene e passare attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm per ottenere la soluzione di prova.
  3. Eseguire la cromatografia come segue. Utilizzare cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con una colonna C18 con dimensioni di 4,6 mm x 250 mm e un diametro interno di 5 μm. Utilizzare acetonitrile come fase mobile A e acqua ultrapura come fase mobile B. Utilizzare i seguenti parametri di eluizione del gradiente: 0-30 min, da 24% A a 26% A; 30-31 min, dal 26% A al 45% A; 31-45 min, da 45% A a 47% A. Utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento di 220 nm (per il rivelatore utilizzato, vedere Tabella dei materiali). Mantenere la temperatura della colonna a 30 °C e la velocità di corrente a 1,0 mL/min e utilizzare una dimensione del campione di 10 μL.
  4. Per studiare la relazione lineare, utilizzare la soluzione di riferimento mista come nel punto 1.1 diluito 2 volte, 4 volte, 8 volte, 16 volte e 32 volte, rispettivamente per icariin, EA, EB, EC e BI. Utilizzare acetonitrile come fase mobile A e acqua ultrapura come fase mobile B.
  5. Utilizzare i seguenti parametri di eluizione del gradiente: 0-30 min, da 24% A a 26% A; 30-31 min, dal 26% A al 45% A; 31-45 min, da 45% A a 47% A. Utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento di 220 nm (per il rivelatore utilizzato, vedere Tabella dei materiali). Mantenere la temperatura della colonna a 30 °C e la velocità di corrente a 1,0 mL/min e utilizzare una dimensione del campione di 10 μL. Infine, registra le aree di picco. Tracciare la regressione lineare con la concentrazione di riferimento (asse x, μg/mL) come ascissa e l'area del picco (asse y) come ordinata utilizzando un software professionale (vedi Tabella dei materiali).
  6. Eseguire la prova di precisione misurando la soluzione di controllo mista sei volte consecutive mediante HPLC utilizzando le condizioni cromatografiche indicate al punto 1.3. Registrare il tempo di rilevamento e le aree di picco di ciascuna composizione chimica e calcolare le deviazioni standard relative (RSD) delle aree di picco per valutare la precisione (riproducibilità) utilizzando la formula seguente:
    RSD% = deviazione standard (SD)/media aritmetica dei risultati calcolati (X) x 100 %
  7. Per eseguire il test di riproducibilità, pesare accuratamente la polvere EF e preparare sei parti della soluzione del prodotto di prova in parallelo secondo il metodo al punto 1.2. Sottoporre le soluzioni preparate all'HPLC nelle condizioni cromatografiche presentate al punto 1.3. Registrare i tempi di ritenzione e le aree di picco di ciascuna composizione chimica e calcolare le quantità di ciascun composto da una curva standard (aree di picco rispetto alle concentrazioni). Calcola l'RSD% come sopra.
  8. Per eseguire la prova di stabilità, conservare le soluzioni di prova a temperatura ambiente e misurarne il contenuto con il metodo HPLC descritto al punto 1.3 a 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h e 24 h dopo la preparazione per valutare la stabilità. Registrare i tempi di ritenzione e le aree di picco di ciascuna composizione chimica e calcolare l'RSD% delle aree di picco come sopra.
  9. Per eseguire la prova di recupero del campione, pesare 0,2 g di polvere EF in un matraccio Erlenmeyer tappato per sei repliche. Aggiungere una quantità appropriata della soluzione di riferimento (la quantità di sostanza di riferimento aggiunta al campione è equivalente al 100% del contenuto noto del campione) e preparare la soluzione campione secondo il metodo presentato al punto 1.2.
  10. Iniettare i campioni nel cromatografo e analizzarli in base alle condizioni cromatografiche al punto 1.3. Registrare le aree di picco e calcolare i valori medi di recupero e RSD% come di seguito:
    Velocità di recupero del campione con spike = (contenuto del campione con picchi − contenuto del campione)/quantità del campione x 100%

2. Ottimizzazione della tecnologia di lavorazione dell'olio di montone EF utilizzando la metodologia della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken

  1. Selezionare i parametri chiave nella lavorazione EF, come la quantità di olio di montone (A; 15% -35%), la temperatura dell'olio di montone (B; 50-120 °C) e la temperatura di frittura (C; 80-300 °C), come fattori influenti. Utilizza i punteggi completi dei contenuti icariin, EA, EB, EC e BI come indici di valutazione. La percentuale di olio di montone qui è la percentuale di massa.
  2. Utilizzare il software di analisi della superficie di risposta (vedere Tabella dei materiali) per progettare gli esperimenti sulla superficie di risposta di Box-Behnken, esplorare la superficie di risposta quadratica e costruire un modello polinomiale del secondo ordine. Selezionare il nuovo design Box-Behnken e impostare l'opzione Fattori numerici su 3; impostare i fattori A, B e C. Fare clic su Continua. Imposta l'opzione Risposte su 1 (che era il punteggio completo). Fare clic su Continua per completare il progetto. Sono stati pianificati in totale 17 esperimenti (cfr . tabella 1).
    NOTA: per le variabili indipendenti e dipendenti, insieme ai relativi livelli basso, medio e alto, vedere la Tabella 2.
  3. Elaborare l'impronta ambientale secondo i parametri specifici della Tabella 1; ad esempio, per il numero d'ordine 1, pesare l'olio di montone raffinato al 15% V / V e quindi riscaldare a 50 ° C per fonderlo. Aggiungere l'EF grezzo al montone fuso, saltare in padella a fuoco delicato (190 °C) fino a quando non è uniformemente lucido, quindi rimuovere e raffreddare. Eseguito 17 interventi sperimentali. In questo lavoro sono stati ottenuti in totale 17 gruppi di prodotti trasformati EF.
    NOTA: L'olio di montone è solido a temperatura ambiente (25 °C) e si scioglie in liquido quando riscaldato. L'olio di montone allo stato liquido può essere usato come eccipiente.
  4. Preparare le soluzioni di prova dei prodotti trasformati secondo il metodo descritto al punto 1.2. Quindi, analizzarli utilizzando HPLC in base alle condizioni cromatografiche descritte nel passaggio 1.3. Registrare i tempi di ritenzione e le aree di picco di ciascuna composizione chimica e calcolare il contenuto di icariina, EA, EB, EC e BI in ciascuna soluzione di prova rispetto a una curva standard esterna. Utilizza la formula di calcolo del punteggio completo qui sotto per calcolare i punteggi completi dei 17 gruppi sperimentali:
    Punteggio completo = Z/Z max × 0,5 + BI/BImax × 0,5
    dove Z è la somma dei contenuti di icariina, EA, EB e CE; Zmax è il valore massimo della somma dei contenuti di icariina, EA, EB e EC nei 17 gruppi sperimentali; BI è il contenuto BI; e BImax è il valore massimo del contenuto di BI nei 17 gruppi sperimentali.
  5. Importare i risultati completi del punteggio per i 17 gruppi di esperimenti nel software di analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali) per analizzare i dati sperimentali. Sotto gli elementi di valutazione, selezionare l'opzione di ordine del processo quadratico e l'opzione del tipo di modello polinomiale.

3. Testare l'effetto della lavorazione sullo sviluppo embrionale del pesce zebra

  1. Preparazione del campione
    1. Schiacciare l'EF grezzo e lavorato attraverso un setaccio n. 3 (vedi Tabella dei materiali). A 100 g di ciascun campione EF, aggiungere 1.000 ml di acqua ultrapura. Immergere l'EF per 0,5 ore, far bollire l'acqua due volte per 30 minuti ciascuna, quindi filtrare con carta da filtro.
    2. Unire i filtrati e concentrare il campione riscaldandolo. Aggiungere acqua ultrapura a un volume finale di 100 ml per ottenere le soluzioni EF (PEF, 1 g/mL) e EF grezze (CEF,1 g/mL). Misurare la quantità di farmaco grezzo in ciascuna soluzione madre.
    3. Introdurre aliquote da 1 mL, 1,5 mL, 2,5 mL, 5 mL e 7,5 mL di soluzioni madre in matraccio volumetrici da 10 ml, quindi aggiungere acqua ultrapura al volume per preparare le soluzioni di prova con concentrazioni di 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL e 750 mg/mL per lo studio sull'embriotossicità del pesce zebra.
      NOTA: Le concentrazioni delle soluzioni campione sono state preparate facendo riferimento alla letteratura pertinente 20,21 ed eseguendo esperimenti preliminari per ottenere il gradiente di concentrazione di10 volte utilizzato nella tossicologia normale. L'MCE era un campione non trasformato e il PEF era un campione preparato con la migliore tecnologia di trattamento descritta nella sezione 2.
  2. Allevamento di pesci zebra e trattamento degli embrioni21
    1. Adattare i pesci zebra selvatici (vedi Tabella dei materiali) a temperatura controllata per 2 giorni, tenerli in un acquario a flusso continuo a pH 7,0-7,4 e nutrirli due volte al giorno.
      NOTA: L'inibizione della formazione di melanina nel pesce zebra è stata ottenuta aggiungendo 1-fenil-2-tiourea in una concentrazione dello 0,003% (massa / volume) al terreno di coltura, che ha mantenuto i loro corpi trasparenti per l'osservazione morfologica.
    2. Seleziona il pesce zebra selvatico fertile adulto la sera e separali usando deflettori nelle scatole di accoppiamento. Rimuovere i deflettori la mattina seguente e lasciare che il pesce deponga le uova per 30 minuti. Raccolte le uova fecondate con un contagocce ogni 15 min. In totale, sono stati raccolti 520 embrioni selvatici sani. Conservare gli embrioni di zebrafish in un'incubatrice a 28,5 °C per 24 ore.
    3. Assegnare in modo casuale gli embrioni sani a 24 ore dopo la fecondazione (hpf) a 13 gruppi e, insieme a un gruppo di controllo, immergere separatamente in 10 ml di ciascuna delle seguenti soluzioni in un piatto di coltura: PEF: 100 μg / mL, 150 μg / mL, 200 μg / mL, 250 μg / mL, 500 μg / mL, 750 μg / mL; CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL. Trattare il gruppo di controllo vuoto con il mezzo come soluzione. Ogni gruppo conteneva 40 embrioni in questo studio.
      NOTA: La composizione media è 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4, 0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 e 4 mM NaHCO3.
    4. Coltiva il pesce zebra in un'incubatrice a temperatura costante fino a 120 hpf. Contare il numero di larve morte ogni giorno, osservare la morfologia degli organi principali delle larve in ciascun gruppo sperimentale sotto uno stereomicroscopio (barra di scala = 500 μm, vedi Tabella dei materiali) e calcolare la concentrazione di mezza morte (LC50) del pesce zebra a 72 hpf utilizzando un software di analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

Risultati dell'indagine metodologica
È stata osservata una relazione lineare tra la concentrazione di icariina, EA, EB, EC, BI e le aree di picco cromatografiche (vedere Tabella 3). I valori RSD% (n = 6) delle aree di picco cromatografiche di icariina, EA, EB, EC e BI erano rispettivamente 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% e 1,06%, indicando che la precisione delle misurazioni HPLC era buona. I valori RSD% (n = 6) dei contenuti di icariina, EA, EB, EC e BI erano rispettivamente 1,59%, 1,46%...

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Discussione

Variabili indipendenti e determinazione dei loro livelli
La tecnologia di elaborazione EF è descritta solo nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese e nelle specifiche locali di elaborazione della medicina cinese pubblicate da 26 province, comuni e regioni autonome in tutto il paese1. La descrizione prevede i seguenti passaggi: prendere l'olio di montone e riscaldarlo per scioglierlo, aggiungere brandelli EF, saltare in padella a fuoco lento fino a quando non è uniforme e lu...

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato dal Basic Scientific Research Business Project della Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (numero di progetto: jbky20200013), dal Performance Incentive Guidance Project degli istituti di ricerca scientifica di Chongqing (numero di progetto: cstc2021jxjl 130025) e dal progetto di costruzione della disciplina chiave della Commissione sanitaria municipale di Chongqing di Chinese Materia Medica Processing.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher197164
Baohuoside figure-materials-103 (Bfigure-materials-195 ) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20042402
Chromatographic columnWaters CorporationSymmetry C18
Design Expert softwareStat- Ease Inc., Minneapolis, MNTrial Version8.0.6.1
DetectorWaters Corporation2998
DisintegratorHefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.S-FS553
Electronic analytical balanceMettler-Toledo International Inc.MS205DU
Epimedin A (EA)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-21112118
Epimedin B (EB)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080403
Epimedin C (EC)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080310
EthanolChongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.20180801
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Waters Corporation2695
IcariinChengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.21091401
MethanolChongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.20171101
Microporous membraneTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.0.22μm
Mutton oilKuoshan Zhiniu Fresh Food Store20211106
Office Excel office softwareMicrosoftOffice Excel 2021
Pharmacopoeia sieveShaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.R40/3
Pure water machineChongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.AT Sro 10A
Qualitative filter paperShanghai Leigu Instrument Co., Ltd.18cm
StereomicroscopeCarl Zeiss, Oberkochen, GermanyStemi 2000
Ultrasonic cleanerBranson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.BUG25-12
ZebrafishChina Zebrafish Resource Center (CZRC)The AB strain

Riferimenti

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