Epimedii Folium 양고기 오일 가공 기술의 최적화 및 제브라피쉬 배아 발달에 미치는 영향 테스트

요약

이 프로토콜에서는 Box-Behnken 실험 설계-반응 표면 방법론을 적용하여 Epimedii folium(EF)의 양고기 오일 가공 기술을 최적화하고, 제브라피쉬 배아 발달에 대한 조잡하고 최적화된 물 추출 EF의 영향을 예비 조사했습니다.

초록

중국 전통 의학(TCM)인 에피메디 폴리움(EF)은 2,000년 > 된 의학 및 식품 분야에서 역사를 가지고 있습니다. 임상적으로 양고기 기름으로 가공한 EF는 약으로 사용되는 경우가 많습니다. 최근에는 EF를 원료로 사용하는 제품의 안전 위험과 부작용에 대한 보고가 점차 증가하고 있습니다. 처리는 TCM의 안전성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다. TCM 이론에 따르면 양고기 기름 가공은 EF의 독성을 줄이고 신장에 대한 강장제 효과를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 EF 양고기 기름 가공 기술에 대한 체계적인 연구와 평가가 부족하다. 이 연구에서는 Box-Behnken 실험 설계-반응 표면 방법론을 사용하여 여러 구성 요소의 내용을 평가하여 처리 기술의 주요 매개변수를 최적화했습니다. 그 결과 EF의 최적 양고기 기름 가공 기술은 다음과 같다: 양고기 기름을 120°C ± 10°C에서 가열하고, 조잡한 EF를 첨가하고, 고르게 광택이 날 때까지 189°C ± 10°C로 부드럽게 볶은 다음, 그것을 제거하고 식힌다. EF 100kg 당 15kg의 양고기 기름을 사용해야합니다. 원유 및 양고기 기름 가공 EF의 수성 추출물의 독성 및 최기형성을 제브라피쉬 배아 발달 모델에서 비교했습니다. 결과는 조잡한 허브 그룹이 제브라 피쉬 기형을 일으킬 가능성이 더 높았으며 최대 치사 EF 농도가 더 낮았다는 것을 보여주었습니다. 결론적으로, 최적화 된 양고기 기름 가공 기술은 안정적이고 신뢰할 수 있으며 반복성이 우수했습니다. 특정 용량에서, EF의 수성 추출물은 제브라 피쉬 배아의 발달에 독성이 있었고, 독성은 가공 된 약물보다 생약에 대해 더 강했다. 결과는 양고기 기름 가공이 원유 EF의 독성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 양고기 기름 가공 EF의 품질, 균일성 및 임상적 안전성을 개선하는 데 사용될 수 있습니다.

서문

Epimedii folium (EF)은 Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.)의 말린 잎입니다. Maxim., Epimedium pubescens Maxim., 또는 Epimedium koreanum Nakai. EF는 골다공증, 갱년기 증후군, 유방 덩어리, 고혈압, 관상 동맥 심장 질환 및 기타 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다¹. 중국 전통 의학(TCM)인 EF는 2,000년 이상의 의학 및 식품 분야의 역사를 가지고 있습니다. 저렴한 가격과 신장을 강화하는 현저한 효과로 인해 의약품 및 건강 식품에 널리 사용됩니다. EF는 양고기 기름으로 볶아서 가공하는데, 이는 Liu Song 시대²의 Lei Xiao가 쓴 Lei Gong Processing Theory에서 처음 설명한 과정입니다. 조잡한 EF와 볶은 EF의 효능은 상당히 다릅니다. 조잡한 EF는 주로 류머티즘을 없애는 반면, 볶은 EF는 신장을 따뜻하게 하여 양³을 강화합니다. 현재 EF는 의약품 및 건강 식품의 원료로 널리 사용되고 있습니다. 중국 특허 의약품 399개, 수입 건강식품 9개, EF를 원료로 하는 국내 건강식품 455개소가^있다. 이 의약 재료는 큰 응용 전망을 가지고 있습니다. 그러나 최근 EF를 원료로 사용하는 건강식품 및 중국 특허의약품으로 인한 이상반응 및 인체간 손상에 대한 보고가 증가하고 있으며, 관련 독성 연구 ^5,6,7에서는 EF를 원료로 하여 잠재적인 안전성 위험이 있다고 보고하고 있습니다.

한약 가공은 독성을 효과적으로 감소 또는 제거하고 TCM의 안전성을 향상시킬 수 있는 제약 기술을 말합니다. EF의 전통적인 가공 방법은 양고기 기름으로 볶는 것인데, 이는 EF의 독성을 감소시키고 신장을 따뜻하게하고 양을 촉진시키는 효과를 향상시킵니다⁸. 이 가공 방법은 중국 약전 및 다양한 가공 사양¹에 포함되어 있습니다. EF의 과정은 다음과 같이 지정됩니다 : EF 100kg 당 양수 20kg (정제 된)을 첨가하고 균일하고 광택이 날 때까지 온화하게 소성합니다¹. 위의 표준에는 엄격한 EF 처리 방법 매개 변수가 없으므로 일관성을 제공하기 위해 로컬 처리 사양이 통합되지 않았습니다. 따라서 EF 프로세스에 대한 체계적인 연구를 수행하는 것이 유용 할 것입니다. 본 논문에서는 EF의 처리 기술을 최적화하기 위해 Box-Behnken 실험 설계-반응 표면 방법을 사용하였다.

Box-Behnken 실험 설계는 공정의 요인을 최적화하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 추출 매개변수는 다중 회귀 방정식 피팅 요인과 효과 값 간의 기능적 관계를 설정하여 최적화할 수 있습니다. 최근에, 이 방법은 TCM 추출 5,6,7 및 처리 ^9,10,11을 연구하는데 널리 이용되고 있다. 다양한 연구에서 소금 가공 Psoraleae fructus¹², 와인 가공 Cnidii fructus¹³ 및 볶은 Cinnamomi ramulus¹⁴와 같은 Box-Behnken 설계에 따라 소금 가공, 와인 가공 및 볶음을 포함하는 TCM 준비 방법이 보고되었습니다. 이 방법은 테스트 시간을 단축하고 테스트 정확도를 높이며 다단계 및 다단계 테스트에 적합합니다. 이 방법은 직교 설계 시험 방법보다 간단하고 균일 설계 방법¹⁵보다 포괄적이다. 얻은 관계는 테스트 범위 내의 모든 테스트 포인트의 예측 값을 결정할 수 있으며 이는 큰 이점입니다. 제브라피쉬 모델은 처리 후 EF의 독성이 덜한지 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

TCM 독성 연구에서, 제브라피쉬 모델은 세포 실험의 높은 처리량과 설치류 실험과의 유사성이라는 두 가지 장점을 가지고 있다¹⁶. 이 모델은 작은 크기, 높은 산란 속도, 짧은 번식주기 및 번식 용이성이 특징입니다. 이 모델은 세포 배양 플레이트에서 대규모 동기 실험에 사용할 수 있으며 실험 약물 투여량이 적고 실험 주기가 짧으며 비용이 저렴하며 전체 실험 과정을 관찰하고 작동하기 쉽습니다¹⁷. 제브라피쉬 배아는 투명하고 빠르게 발달합니다. 그러므로, 상이한 발달 단계에서 내장 조직에 대한 약물의 독성 및 기형 유발 효과는 현미경으로 직접 관찰할 수 있다¹⁸. 제브라피쉬와 인간 사이의 유전자 상동성은 85%에 달합니다¹⁸. 제브라피쉬의 신호 전달 경로는 인간의 신호 전달 경로와 유사하다¹⁸. 제브라피쉬의 생물학적 구조와 생리적 기능은 포유류의 그것과 매우 유사하다¹⁸. 그러므로, 약물 실험을 위한 제브라피쉬 모델은 인간에게 신뢰할 수 있고 완전히 적용할 수 있는 실험 동물을 제공할 수 있다¹⁹.

본 연구에서는 Box-Behnken 설계-반응 표면 방법론을 사용하여 EF 가공 기술에 사용되는 양고기 기름의 양과 온도, 튀김 온도를 최적화하였으며, 이카리인, 에피메딘 A, 에피메딘 B, 에피메딘 C, 바오후오사이드 I의 함량을 평가 지표로 하였다. 제브라피쉬 모델은 EF에 대한 처리의 감쇠 효과를 평가하기 위해 처리 전후에 제브라피쉬 배아 발달에 대한 EF 물 추출물의 효과를 예비 적으로 탐색하는 데 사용되었습니다.

프로토콜

모든 동물 관련 실험은 충칭 중의학연구소 실험윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다(실험동물윤리심의인증서 번호: ZJS2022-03).

1. 생리 활성 성분의 결정

참고: 이 연구에 사용된 종은 Epimedium sagittatum이었고 샘플은 충칭 Fengdu County에서 수집되었습니다. 샘플은 E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) 격언. 충칭 중국 전통 의학 연구소 생물 의학 연구소의 연구원에 의해.

1. 전자 분석 저울을 사용하여 각 기준 물질, 즉 icariin, epimedin A(EA), epimedin B(EB), epimedin C(EC) 및 baohuoside I(BI)의 적정량을 정확하게 칭량하여 대조 제품 용액을 준비하고 메탄올에 용해시킵니다. 이를 사용하여 381.61 μg/mL 이카리인, 124.14 μg/mL EA, 110.24 μg/mL EB, 1091.75 μg/mL EC 및 184.98 μg/mL BI를 포함하는 혼합 기준 원액을 제조합니다.
2. EF를 3번 체로 분쇄하여 시험산물을 준비한다. 약 0.2g(전자 분석 저울 사용)의 분쇄된 EF를 마개가 있는 삼각 플라스크에 넣고 20mL의 묽은 에탄올을 첨가한 다음 400W 전력 및 50kHz 주파수에서 1시간 동안 초음파를 처리합니다. 잘 흔들어 0.22μm 멤브레인 필터를 통과시켜 시험액을 얻었다.
3. 다음과 같이 크로마토그래피를 수행합니다. 크기가 4.6mm x 250mm이고 내경이 5μm인 C₁₈ 컬럼의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용합니다. 아세토니트릴을 이동상 A로, 초순수를 이동상 B로 사용하십시오. 다음 구배 용출 파라미터를 사용하십시오: 0-30분, 24% A에서 26% A; 30-31분, 26% A 내지 45% A; 31-45분, 45% A - 47% A. 220nm의 감지 파장을 사용합니다(사용된 검출기의 경우 재료 표 참조). 컬럼 온도를 30°C로 유지하고 전류 속도를 1.0mL/분으로 유지하고 10μL의 샘플 크기를 사용합니다.
4. 선형 관계를 조사하기 위해 1.1단계와 같이 혼합된 기준 용액을 사용하여 이카리인, EA, EB, EC, BI에 대해 각각 2배, 4배, 8배, 16배, 32배로 희석한다. 아세토니트릴을 이동상 A로, 초순수를 이동상 B로 사용합니다.
5. 다음의 그래디언트 용출 파라미터 사용: 0-30분, 24% A - 26% A; 30-31분, 26% A 내지 45% A; 31-45분, 45% A - 47% A. 220nm의 감지 파장을 사용합니다(사용된 검출기의 경우 재료 표 참조). 컬럼 온도를 30°C로 유지하고 전류 속도를 1.0mL/분으로 유지하고 10μL의 샘플 크기를 사용합니다. 마지막으로 피크 영역을 기록합니다. 전문 소프트웨어를 사용하여 기준 농도(x축, μg/mL)를 가로좌표로, 피크 면적(y축)을 세로좌표로 하여 선형 회귀를 플로팅합니다( 재료 표 참조).
6. 단계 1.3에 나타낸 크로마토그래피 조건을 사용하여 HPLC로 혼합된 대조 용액을 6회 연속으로 측정하여 정밀 테스트를 수행합니다. 각 화학 성분의 검출 시간과 피크 면적을 기록하고 피크 면적의 상대 표준 편차(RSD)를 계산하여 아래 공식을 사용하여 정밀도(재현성)를 평가합니다.
   RSD% = 계산된 결과의 표준 편차(SD)/산술 평균(X) x 100%
7. 재현성 시험을 수행하기 위해, EF 분말을 정확하게 칭량하고, 단계 1.2의 방법에 따라 시험 생성물 용액의 6개 부분을 병렬로 제조한다. 준비된 용액을 단계 1.3에 제시된 크로마토그래피 조건 하에서 HPLC에 적용한다. 각 화학 성분의 머무름 시간과 피크 면적을 기록하고 표준 곡선(피크 면적 대 농도)에서 각 화합물의 양을 계산합니다. 위와 같이 RSD%를 계산합니다.
8. 안정성 시험을 수행하기 위해, 시험 용액을 실온에서 저장하고, 제조 후 0시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간에서 단계 1.3에 기재된 HPLC 방법으로 이들의 함량을 측정하여 안정성을 평가한다. 각 화학 성분의 머무름 시간과 피크 면적을 기록하고 위와 같이 피크 면적의 RSD %를 계산합니다.
9. 샘플 회수 테스트를 수행하려면 0.2g의 EF 분말을 마개가 있는 삼각 플라스크에 넣고 6회 반복합니다. 적절한 양의 기준 용액을 첨가하고(시료에 첨가된 기준 물질의 양은 시료의 알려진 함량의 100%에 해당함) 1.2단계에서 제시된 방법에 따라 시험 용액을 준비합니다.
10. 시료를 크로마토그래피에 주입하고 단계 1.3의 크로마토그래피 조건에 따라 분석한다. 피크 면적을 기록하고 아래와 같이 평균 회복 및 RSD% 값을 계산합니다.
    스파이크 샘플 회수율 = (스파이크 샘플 함량 - 샘플 함량)/샘플 양 x 100%

2. Box-Behnken 설계-반응 표면 방법론을 이용한 EF 양고기 기름 가공 기술 최적화

1. 양고기 기름의 양(A; 15%-35%), 양고기 기름 온도(B; 50-120 °C) 및 튀김 온도(C; 80-300 °C)와 같은 EF 가공의 주요 매개변수를 영향 요인으로 선택합니다. icariin, EA, EB, EC 및 BI 콘텐츠의 종합 점수를 평가 지표로 사용합니다. 여기서 양고기 기름의 비율은 질량 비율입니다.
2. 반응 표면 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 Box-Behnken 반응 표면 실험을 설계하고, 2차 반응 표면을 탐색하고, 2차 다항식 모델을 생성합니다. 새 Box-Behnken 설계를 선택하고 숫자 계수 옵션을 3으로 설정합니다. 요소 A, B, C를 설정합니다. 계속을 클릭합니다. 응답 옵션을 1(종합 점수)로 설정합니다. 계속 을 클릭하여 디자인을 완성합니다. 총 17개의 실험이 계획되었다( 표 1 참조).
   참고: 독립 변수와 종속 변수, 그리고 그 하위, 중간 및 상위 수준에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
3. 표 1의 특정 파라미터에 따라 EF를 처리하고; 예를 들어, 주문 번호 1의 경우 정제된 양고기 기름을 15% v/v로 칭량한 다음 50°C로 가열하여 녹입니다. 녹인 양고기에 조잡한 EF를 넣고 불(190°C)에서 고르게 윤기가 날 때까지 볶은 다음 꺼내 식힌다. 17 개의 실험 작업을 수행했습니다. 이 작업에서 총 17 개의 EF 가공 제품 그룹이 얻어졌습니다.
   알림: 양고기 기름은 실온(25°C)에서 고체이며 가열하면 액체로 녹습니다. 액체 상태의 양고기 오일은 부형제로 사용될 수 있습니다.
4. 단계 1.2에 기술된 방법에 따라 가공된 제품의 시험 용액을 준비한다. 이어서, 단계 1.3에 기술된 크로마토그래피 조건에 따라 HPLC를 사용하여 이들을 분석한다. 각 화학 성분의 머무름 시간과 피크 면적을 기록하고 외부 표준 곡선에 대해 각 테스트 용액의 icariin, EA, EB, EC 및 BI의 함량을 계산합니다. 아래의 종합 점수 계산 공식을 사용하여 17개 실험 그룹의 종합 점수를 계산하십시오.
   종합 점수 = Z/Z 최대 × 0.5 + BI/BI_최대 × 0.5
   여기서 Z는 icariin, EA, EB 및 EC 내용의 합계입니다. _Zmax 는 17개 실험군에서 이카리인, EA, EB 및 EC 함량의 합에 대한 최대값이다. BI는 BI 콘텐츠입니다. BI_max 는 17개 실험군에서 BI 콘텐츠의 최대값입니다.
5. 17개 실험 그룹에 대한 종합 채점 결과를 데이터 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)로 가져와 실험 데이터를 분석합니다. 평가 항목에서 2차 공정 순서 옵션과 다항식 모델 유형 옵션을 선택합니다.

3. 제브라피쉬 배아 발달에 대한 처리 효과 테스트

1. 시료 전처리
   1. 원유와 가공된 EF를 3번 체로 분쇄합니다( 재료 표 참조). 각 EF 샘플 100g에 초순수 1,000mL를 추가합니다. EF를 0.5 시간 동안 담그고 물을 각각 30 분 동안 두 번 끓인 다음 여과지로 걸러냅니다.
   2. 여과액을 결합하고 가열하여 샘플을 농축합니다. 최종 부피 100mL에 초순수를 첨가하여 처리된 EF(PEF, 1g/mL) 및 원유 EF(CEF, 1g/mL) 원액을 얻습니다. 각 원액에서 원료 약물의 양을 측정합니다.
   3. 10mL 부피 플라스크에 1mL, 1.5mL, 2.5mL, 5mL 및 7.5mL 원액의 분취액을 넣은 다음 부피에 초순수를 추가하여 제브라피쉬 배아 독성 연구를 위해 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL, 250mg/mL, 500mg/mL 및 750mg/mL 농도의 테스트 용액을 준비합니다.
      참고: 시험 용액의 농도는 관련 문헌 ^20,21을 참조하고 예비 실험을 수행하여 일반 독성학에서 사용되는¹⁰배 농도 구배를 수득하여 제조되었습니다. CEF는 처리되지 않은 샘플이었고, PEF는 섹션 2에 설명된 최상의 처리 기술로 제조된 샘플이었습니다.
2. 제브라피쉬 축산 및 배아 처리²¹
   1. 야생형 제브라 피쉬 ( 재료 표 참조)를 2 일 동안 제어 된 온도에서 적응시키고 pH 7.0-7.4의 통과 수족관에 보관하고 하루에 두 번 먹이십시오.
      참고: 제브라피쉬의 멜라닌 형성 억제는 배양 배지에 0.003%(질량/부피) 농도의 1-페닐-2-티오우레아를 첨가하여 형태학적 관찰을 위해 몸을 투명하게 유지함으로써 달성되었습니다.
   2. 저녁에 성체 비옥 야생형 제브라 피쉬를 선택하고 짝짓기 상자에 배플을 사용하여 분리하십시오. 다음날 아침 배플을 제거하고 물고기가 30분 동안 산란할 수 있도록 합니다. 15분마다 점적기로 수정란을 모았습니다. 총 520 개의 건강한 야생형 배아가 수집되었습니다. 제브라피쉬 배아를 28.5°C의 인큐베이터에서 24시간 동안 보관합니다.
   3. 수정 후 24시간(hpf)에 건강한 배아를 13개 그룹에 무작위로 할당하고 한 대조군과 함께 배양 접시에 다음 각 용액 10mL에 별도로 담근다: PEF: 100μg/mL, 150μg/mL, 200μg/mL, 250μg/mL, 500μg/mL, 750μg/mL; CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL. 블랭크 대조군을 배지로 용액으로 처리한다. 이 연구에는 각 그룹에 40개의 배아가 포함되어 있습니다.
      참고: 배지 조성은 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.45 mM_KH2PO4, 1.3mM_CaCl2, 1.0 mM_MgSO4, 및 4 mM NaHCO3이다.
   4. 최대 120hpf의 항온 인큐베이터에서 제브라피쉬를 배양합니다. 매일 죽은 유충의 수를 세고, 각 실험군에서 유충의 주요 장기 형태를 실체현미경(스케일 바 = 500μm, 재료 표 참조)으로 관찰하고, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 72hpf에서 제브라피쉬의 반감기 농도(LC₅₀)를 계산합니다(재료 표 참조).

결과

방법론적 조사 결과
이카리인, EA, EB, EC, BI 및 크로마토그래피 피크 영역의 농도 사이의 선형 관계가 관찰되었다( 표 3 참조). 이카리인, EA, EB, EC 및 BI의 크로마토그래피 피크 영역의 RSD%값(n=6)은 각각 0.28%, 1.22%, 0.65%, 1.67%, 1.06%였으며, 이는 HPLC 측정의 정밀도가 양호함을 나타낸다. 이카리인, EA, EB, EC, BI의 함량의 RSD%값(n=6)은 각각 1.59%, 1.46%, 1.86%, 2.29%, 0.98%로 되어 반복성이...

토론

독립 변수 및 그 수준의 결정
EF 가공 기술은 중국 약전 2020년판과 전국 26개 성, 시, 자치구에서 발표한 현지 한약 가공 사양에만 설명되어 있습니다¹. 설명에는 양고기 기름을 가져다가 녹일 때까지 가열하고, EF 조각을 넣고, 균일하고 광택이 날 때까지 천천히 불로 볶고, 꺼내서 식히는 단계가 포함됩니다. 또한 Epimedium 100kg당 20kg(정제된 양고기 기름 20%)이 사용됩?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher	197164
Baohuoside (B )	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20042402
Chromatographic column	Waters Corporation	Symmetry C18
Design Expert software	Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN	Trial Version8.0.6.1
Detector	Waters Corporation	2998
Disintegrator	Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.	S-FS553
Electronic analytical balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS205DU
Epimedin A (EA)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-21112118
Epimedin B (EB)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080403
Epimedin C (EC)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080310
Ethanol	Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.	20180801
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)	Waters Corporation	2695
Icariin	Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.	21091401
Methanol	Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.	20171101
Microporous membrane	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.	0.22μm
Mutton oil	Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store	20211106
Office Excel office software	Microsoft	Office Excel 2021
Pharmacopoeia sieve	Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.	R40/3
Pure water machine	Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.	AT Sro 10A
Qualitative filter paper	Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.	18cm
Stereomicroscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Stemi 2000
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.	BUG25-12
Zebrafish	China Zebrafish Resource Center (CZRC)	The AB strain