Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

Resumen

Se describe un procedimiento para estudiar la dinámica del metabolismo del ADN mitocondrial (ADNmt) en las células utilizando un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia automatizadas para detectar y cuantificar la síntesis y distribución del ADNmt. Esto se puede utilizar aún más para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt.

Resumen

La gran mayoría de los procesos celulares requieren un suministro continuo de energía, cuyo portador más común es la molécula de ATP. Las células eucariotas producen la mayor parte de su ATP en las mitocondrias por fosforilación oxidativa. Las mitocondrias son orgánulos únicos porque tienen su propio genoma que se replica y se transmite a la siguiente generación de células. En contraste con el genoma nuclear, hay múltiples copias del genoma mitocondrial en la célula. El estudio detallado de los mecanismos responsables de la replicación, reparación y mantenimiento del genoma mitocondrial es esencial para comprender el buen funcionamiento de las mitocondrias y las células enteras tanto en condiciones normales como de enfermedad. Aquí se presenta un método que permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADN mitocondrial (ADNmt) en células humanas cultivadas in vitro . Este enfoque se basa en la detección por inmunofluorescencia de moléculas de ADN sintetizadas activamente marcadas por la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) y la detección concurrente de todas las moléculas de ADNmt con anticuerpos antiADN. Además, las mitocondrias se visualizan con colorantes o anticuerpos específicos. El cultivo de células en un formato de múltiples pocillos y la utilización de un microscopio de fluorescencia automatizado facilitan el estudio de la dinámica del ADNmt y la morfología de las mitocondrias en una variedad de condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto.

Introducción

Para la mayoría de las células eucariotas, las mitocondrias son orgánulos esenciales, ya que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos celulares. En primer lugar, las mitocondrias son los principales proveedores de energía de las células¹. Las mitocondrias también están involucradas en la regulación de la homeostasis celular (por ejemplo, redox^{2 intracelular} y el balance de calcio³), la señalización celular ^4,5, la apoptosis⁶, la síntesis de diferentes compuestos bioquímicos

Protocolo

1. Preparación de la mezcla de siRNA

1. Un día antes del inicio del experimento, células semilla (por ejemplo, HeLa) en un plato de 100 mm para que alcancen una confluencia del 70% -90% al día siguiente.
   NOTA: Todas las operaciones deben realizarse en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar.
2. Preparar la cantidad adecuada de siRNA diluido a una concentración de 140 nM en medio Opti-MEM (ver Tabla de materiales). Una placa de 96 pocillos se puede utilizar como depósito.
3. Agregue 5 μL de la solución de ARNip (o medio Opti-MEM para las muestras de control) a cada pocillo de una microplaca de culti....

Discusión

Históricamente, el etiquetado de ADN por incorporación de BrdU y detección de anticuerpos se ha utilizado en la replicación del ADN nuclear y la investigación del ciclo celular 14,27,28. Hasta ahora, todos los protocolos para detectar ADN marcado con BrdU han incluido un paso de desnaturalización del ADN (ácido o térmico) o digestión enzimática (DNasa o proteinasa) para permitir la exposición al epítopo y facilitar l.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus