כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

Summary

מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.

Abstract

הרוב המכריע של תהליכים תאיים דורשים אספקה רציפה של אנרגיה, המוביל הנפוץ ביותר של אשר הוא מולקולת ATP. תאים אאוקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP שלהם במיטוכונדריה על ידי זרחן חמצוני. מיטוכונדריה הם אברונים ייחודיים מכיוון שיש להם גנום משלהם המשוכפל ומועבר לדור הבא של התאים. בניגוד לגנום הגרעיני, ישנם עותקים רבים של הגנום המיטוכונדריאלי בתא. המחקר המפורט של המנגנונים האחראים לשכפול, תיקון ותחזוקה של הגנום המיטוכונדריאלי חיוני להבנת תפקודם התקין של מיטוכונדריה ותאים שלמים בתנאי נורמליות ומחלות כאחד. כאן מוצגת שיטה המאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית . גישה זו מבוססת על זיהוי אימונופלואורסצנטי של מולקולות DNA מסונתזות באופן פעיל המסומנות על ידי שילוב 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) וזיהוי בו זמנית של כל מולקולות mtDNA עם נוגדנים נגד DNA. נוסף על כך, מדמיינים את המיטוכונדריה בעזרת צבעים או נוגדנים ספציפיים. גידול תאים בפורמט רב-באר ושימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי מקלים על חקר הדינמיקה של mtDNA והמורפולוגיה של המיטוכונדריה במגוון תנאי ניסוי בזמן קצר יחסית.

Introduction

עבור רוב התאים האיקריוטים, מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים, שכן הם ממלאים תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. בראש ובראשונה, מיטוכונדריה הם ספקי האנרגיה העיקריים של תאים¹. מיטוכונדריה מעורבים גם בוויסות הומאוסטזיס תאי (לדוגמה, חמצון-חיזור תוך-תאי² ומאזן הסידן³), איתות תאי ^4,5, אפופטוזיס⁶, סינתזה של תרכובות ביוכימיות שונות^7,8, והתגובה החיסונית המולדת⁹. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למצבים פתולוגיים שונים ולמחלות אנושיות¹⁰.

תפקוד המיטוכונדריה תלוי במידע הגנטי הנמצא בשני גנומים נפרדים: הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי. הגנום המיטוכונדריאלי מקודד מספר קטן של גנים בהשוואה לגנום הגרעיני, אך כל הגנים המקודדים ב-mtDNA חיוניים לחיי האדם. מנגנון החלבונים המיטוכונדריאליים הדרוש לשמירה על mtDNA מקודד על ידי nDNA. המרכיבים הבסיסיים של הרפליזום המיטוכונדריאלי, כמו גם כמה גורמים ביוגנזה מיטוכונדריאלית, כבר זוהו (נסקרו במחקר קודם^11,12). עם זאת, מנגנוני השכפול והתחזוקה של הדנ"א המיטוכונדריאלי עדיין רחוקים מלהיות מובנים. בניגוד ל-nDNA, הגנום המיטוכונדריאלי קיים במספר עותקים, מה שמספק שכבה נוספת לוויסות ביטוי גנים מיטוכונדריאליים. הרבה פחות ידוע כיום על התפלגות והפרדה של mtDNA בתוך אברונים, באיזו מידה תהליכים אלה מוסדרים, ואם כן, אילו חלבונים מעורבים¹³. דפוס ההפרדה הוא חיוני כאשר תאים מכילים אוכלוסייה מעורבת של mtDNA מסוג בר ומוטציה. התפלגות לא שוויונית שלהם עלולה להוביל ליצירת תאים עם כמות מזיקה של mtDNA מוטציה.

עד כה, הגורמים החלבוניים הדרושים לתחזוקת mtDNA זוהו בעיקר בשיטות ביוכימיות, ניתוחים ביואינפורמטיים או באמצעות מחקרים הקשורים למחלות. בעבודה זו, על מנת להבטיח סיכוי גבוה לזיהוי גורמים שחמקו בעבר מזיהוי, מתוארת אסטרטגיה שונה. השיטה מבוססת על תיוג של mtDNA במהלך שכפול או תיקון עם 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), אנלוג נוקלאוזיד של תימידין. BrdU משולב בקלות בגדילי דנ"א מתהווים במהלך סינתזת דנ"א, ובאופן כללי, משמש לניטור שכפול דנ"א גרעיני¹⁴. עם זאת, ההליך שפותח כאן הותאם לאיתור BrdU המשולב ב- mtDNA באמצעות אימונופלואורסנציה של נוגדנים נגד BrdU.

הגישה מאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזת mtDNA והפצה בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית. יש צורך באסטרטגיית תפוקה גבוהה כדי לבצע בדיקות בתנאי ניסוי שונים בזמן קצר יחסית; לכן, מוצע בפרוטוקול להשתמש בפורמט רב בארות לתרבית תאים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי להדמיה. הפרוטוקול כולל העברה של תאי HeLa אנושיים עם ספריית siRNA וניטור עוקב של שכפול או תיקון mtDNA באמצעות תיוג מטבולי של DNA מסונתז חדש עם BrdU. גישה זו משולבת עם immunostaining של ה- DNA בעזרת נוגדנים anti DNA. שני הפרמטרים מנותחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי. נוסף על כך, מדמיינים מיטוכונדריה באמצעות צבע מסוים. כדי להדגים את הספציפיות של הפרוטוקול, צביעת BrdU נבדקה על תאים נטולי mtDNA (תאי rho0), על תאי HeLa על השתקה של גורמי תחזוקה ידועים של mtDNA, ועל תאי HeLa לאחר טיפול במעכב שכפול mtDNA. רמות mtDNA נמדדו גם בשיטה עצמאית, כלומר qPCR.

Protocol

1. הכנת תערובת siRNA

1. יום לפני תחילת הניסוי, תאי זרע (למשל, HeLa) על צלחת של 100 מ"מ, כך שהם מגיעים למפגש של 70%-90% למחרת.
   הערה: כל הפעולות חייבות להתבצע בתנאים סטריליים בתא זרימה למינרי.
2. הכינו את הכמות המתאימה של siRNA מדולל לריכוז של 140 ננומטר בתווך Opti-MEM (ראו טבלת חומרים). צלחת 96 בארות יכולה לשמש כמאגר.
3. הוסף 5 μL של תמיסת siRNA (או מדיום Opti-MEM עבור דגימות הבקרה) לכל באר של מיקרו-צלחת שחורה של תרבית תאים בת 384 בארות.
   הערה: בהתאם למספר דגימות ה-siRNA שנבדקו, ניתן להשתמש בפיפט אלקטרוני או רב-ערוצי.
4. הכן את הכמות המתאימה של תמיסת מגיב טרנספקציה RNAiMAX (ראה טבלת חומרים) בתווך Opti-MEM. הוסף 1 μL של RNAiMAX עבור כל 100 μL של בינוני.
5. הוסף 10 μL של תמיסת מגיב transfection לכל באר של צלחת 384 באר. הדרך הנוחה והמהירה ביותר לעשות זאת היא עם מתקן מגיב.
6. לדגור את siRNA עם מגיב transfection במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

2. הכנת תאים לטרנספקציה

1. במהלך הדגירה (שלב 1.6), שאפו את המדיום באמצעות מכשיר יניקה (ראו טבלת חומרים), ושטפו את התאים עם 3 מ"ל PBS.
2. הוסף 1.5 מ"ל של טריפסין מדולל 1: 2 ב PBS, ולדגור את התאים ב 37 ° C במשך 10 דקות.
3. בדוק אם התאים התנתקו; אם כן, הוסף 3 מ"ל של מדיום DMEM עם 10% FBS. להשעות את התאים ביסודיות, ולהעביר אותם צינור 15 מ"ל. קח לפחות 150 μL של התרחיף, וספור את התאים בתא ספירת תאים (ראה טבלה של חומרים).
4. הכינו תרחיף תאים בריכוז המתאים (35,000/מ"ל לקו HeLa) בתווך DMEM עם 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין.

3. טרנספקציה של תאים

1. הוסף 20 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות מתקן מגיב. התוצאה תהיה 700 תאים שנזרעו לכל באר.
2. לדגור על התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להניח אותם באינקובטור במשך 72 שעות (37 ° C ו 5% CO₂).

4. התאגדות BrdU

1. הכינו תמיסה של 90 מיקרומטר של BrdU (ראו טבלת חומרים) בתווך DMEM עם 10% FBS.
2. 56 שעות לאחר התמרת siRNA (16 שעות לפני קיבוע התא), הוסף 10 μL של 90 מיקרומטר תמיסת BrdU לכל באר של צלחת 384 בארות (ריכוז BrdU הסופי הוא 20 μM).
   הערה: יש לבצע את הפעולה מהר ככל האפשר; לכן, עדיף להשתמש מתקן מגיב, פיפטה אלקטרונית, או פיפטה רב מתקן. זכור להכין בארות בקרה ללא תוספת של BrdU.
3. לדגור על התאים במשך 16 שעות (37 ° C ו 5% CO₂).

5. תיוג מיטוכונדריה

1. הכינו תמיסה של 20 מיקרומטר של BrdU ב-DMEM עם 10% FBS, והוסיפו לה את תמיסת הצבע למעקב מיטוכונדריה (ראו טבלת חומרים) לריכוז של 1.1 מיקרומטר.
2. 15 שעות לאחר תחילת שילוב BrdU (שעה אחת לפני קיבוע התא), הוסף 10 μL של תמיסת צבע מעקב מיטוכונדריה (ראה טבלת חומרים) לכל באר של צלחת 384 בארות (ריכוז הצבע הסופי הוא 200 ננומטר).
   הערה: השתמש במתקן מגיבים, פיפטה אלקטרונית או פיפטה מרובת מתקנים. זכור לשמור על בארות שליטה ללא תוספת של BrdU אלא עם תוספת של צבע מעקב מיטוכונדריה.
3. לדגור על התאים במשך 1 שעות (37 ° C ו 5% CO₂).

6. קיבוע תאים

הערה: כל הכביסה מתבצעת בצורה הנוחה ביותר באמצעות מכונת כביסה microplate, בעוד תוספת של ריאגנטים מתבצעת במהירות הגבוהה ביותר באמצעות מתקן מגיב.

1. באמצעות מכונת הכביסה microplate (ראה טבלה של חומרים), לשטוף כל באר פעמיים עם 100 μL של PBS. לאחר הכביסה השנייה, להשאיר 25 μL של PBS בבאר.
   הערה: השארת PBS בבאר מפחיתה את הסבירות לניתוק תאים במהלך הוספת נוזל בשלב הבא. כל השטיפות הושלמו עם PBS נשאר בפנים; לכן, התמיסה שנוספה בשלב הבא צריכה תמיד להיות מוכנה בריכוז של פי 2 מכיוון שהיא תתווסף בנפח שווה ל- PBS הנותר.
2. תקן את התאים על ידי הוספת 25 μL של תמיסת פורמלדהיד 8% ב- PBS עם 0.4% Triton X-100 ו- Hoechst 33342 בריכוז של 4 מיקרוגרם / מ"ל (הריכוזים הסופיים של ריאגנטים בודדים הם 4%, 0.2% ו- 2 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) (ראה טבלת חומרים).
3. דוגרים על הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

7. חסימה

1. יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, להשאיר 25 μL של PBS בבאר.
2. הוסף 25 μL של 6% BSA ב- PBS (ריכוז BSA הסופי הוא 3%) לכל באר.
3. דוגרים על הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

8. הוספת הנוגדנים הראשוניים

1. שואפים את BSA באמצעות מכונת כביסה microplate, ולהשאיר 10 μL של פתרון בבאר.
2. הוסף 10 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית שהוכנה ב -3% BSA ב- PBS. השתמשו באנטי-BrdU ב-0.8 מיקרוגרם/מ"ל ובאנטי-דנ"א ב-0.4 מיקרוגרם/מ"ל (הריכוזים הסופיים של נוגדנים הם 0.4 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה) (ראו טבלת חומרים).
3. לדגור את הצלחת בחושך ב 4 ° C במשך הלילה.

9. הוספת נוגדנים משניים

1. יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, להשאיר 10 μL של PBS בבאר.
2. הוסף 10 μL של תמיסת נוגדנים משנית 4 מיקרוגרם/מ"ל שהוכנה ב-6% BSA ב-PBS (הריכוז הסופי הוא 2 מק"ג/מ"ל). השתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזוטיפ (IgG1 נגד עכבר ונגד עכבר IgM) מצומדים לפלואורוכרום כגון Alexa Fluor 488 ו- Alexa Fluor 555 (ראה טבלת חומרים).
3. דוגרים על הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה.
4. יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר 50 μL של PBS בבאר.
5. אטמו את הצלחת בסרט איטום דביק (ראו טבלת חומרים), ואחסנו אותה בחושך בטמפרטורה של 4°C. יש לבצע הדמיה תוך שבועיים.

10. הדמיה

הערה: יש לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי בעל שדה רחב; המיקרוסקופ חייב להיות מצויד בשלב מנוע המסופק עם פקדים כדי לצלם אזורים בודדים של הצלחת באופן אוטומטי.

1. בדוק את הגדרות המיקוד האוטומטי באזורים הפינתיים של הצלחת (בארות A1, A24, P24, P1) ובמרכז.
   הערה: להדמיה, מומלץ להשתמש ביעד מרחק עבודה קצר פי 20 (ראה טבלת חומרים) עם הצמצם המספרי הגבוה ביותר האפשרי.
2. בהתבסס על היסטוגרמות העוצמה שנוצרו על-ידי תוכנת ההדמיה במצב תצוגה חיה, בחרו זמן חשיפה ארוך מספיק לערוצי הפלואורסצנטיות הבודדים, כך שהתמונה המתקבלת לא תהיה רוויה יתר על המידה.
3. הגדר את מספר המישורים המתאים להדמיה על ציר z.
   הערה: שדה הראייה בהגדלה של 20x גדול מספיק כך שלא כל התאים נמצאים באותו מישור מיקוד, ולכן יש לבצע חתך z כדי להציג את כל התאים במישור המיקוד הנכון שלהם. בדרך כלל, חמישה מטוסים מספיקים. בהתאם לזמינות שטח הדיסק, ניתן לשמור ערימות z בודדות או רק הקרנות בעוצמה מרבית. ניתוח התמונה המוצג בסעיף התוצאות המייצגות מבוסס על הקרנות בעוצמה מרבית.
4. בחר את מספר שדות הראייה המתאים להצגה לכל באר.
   הערה: בהתאם למפגש, ניתן לצלם כ- 60-300 תאים בשדה ראייה אחד. בדרך כלל, עבור תאי HeLa עם מפגש של 60%-90%, הדמיה של חמישה שדות ראייה תאפשר לנתח מ-500 תאים ליותר מ-1,000 תאים.
5. בחר את הבארות שברצונך לצלם והתחל בהדמיה.

11. ניתוח תמונה כמותי

הערה: ניתן לבצע ניתוח כמותי של תמונות שנרכשו באמצעות תוכנת קוד פתוח כגון Cell Profiler¹⁵. במחקר הנוכחי, הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ScanR 3.0.0 (ראה טבלת חומרים).

1. התחל את הניתוח על ידי ביצוע תיקון רקע עבור כל התמונות מכל ערוצי הפלואורסצנציה. בהתאם לגודל העצמים שנותחו, בחרו את גודל המסנן המתאים: 80 פיקסלים לגרעיני תאים ו-4 פיקסלים לכתמי BrdU ו-mtDNA.
2. התחילו לפלח את התמונה על ידי יצירת מסיכה של העצם הראשי בהתבסס על היחס בין עוצמת האות הפלואורסצנטי לרקע של הערוץ המתאים לגרעיני התא.
3. צרו מסיכות לתת-עצמים המייצגים את כתמי BrdU ו-mtDNA, בהתאמה, באמצעות תעלות פלואורסצנטיות המתאימות למבנים הנתונים.
   הערה: כל תת-אובייקט מוקצה לאובייקט הראשי הקרוב ביותר (גרעין התא).
4. קבעו את הפרמטרים שיימדדו במהלך הניתוח, ומדו את עוצמת הפיקסלים הבודדים בכל מסיכה עבור כל ערוצי הפלואורסצנטיות.
   הערה: כמו כן, יש לחשב את מספר תת-האובייקטים שהוקצו לגרעין תא נתון ואת השטח של כל תת-אובייקט.
5. הגדר את הפרמטרים הנגזרים שיחושבו בהתבסס על הנתונים המתקבלים. כדי לקבל את העוצמות הפלואורסצנטיות הכוללות עבור ערוץ BrdU או mtDNA, סכמו את העוצמות של כל תת-האובייקטים שהוקצו לגרעין תא נתון. כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, חלק את עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת בסכום השטח של תת-העצמים שהוקצו לגרעין תא נתון.
   הערה: כדי להבטיח שתת-האובייקט שנוצר (BrdU או mtDNA spot) אכן ממוקם במיטוכונדריה, יש צורך לשער אותם בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות של צבע מעקב המיטוכונדריה.
6. בצע ניתוח נוסף של הנתונים המתקבלים באמצעות תוכנת ScanR באמצעות התוכנה הסטטיסטית R 4.2.2¹⁶ יחד עם החבילות הבאות: dplyr 17, data.table¹⁸, ggplot2¹⁹ ו- ggpubr²⁰. שלב זה הוא אופציונלי.

תוצאות

סכימה של ההליך לחקר התפוקה הגבוהה של הדינמיקה של סינתזה והפצה של mtDNA מוצגת באיור 1. השימוש בפורמט של צלחת מרובת בארות מאפשר ניתוח סימולטני של תנאי ניסוי רבים ושונים, כגון השתקה של גנים שונים באמצעות ספריית siRNA. התנאים המשמשים לתיוג של מולקולות דנ"א מסונתזות חדשות עם BrdU מאפשר?...

Discussion

מבחינה היסטורית, תיוג DNA על ידי שילוב BrdU וזיהוי נוגדנים שימש בשכפול DNA גרעיני ומחקר מחזור התא 14,27,28. עד כה, כל הפרוטוקולים לזיהוי DNA המסומן ב- BrdU כללו שלב דנטורציה של DNA (חומצי או תרמי) או עיכול אנזים (DNase או פרוטאינאז) כדי לאפשר חשיפה לאפיטופים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus