Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Dynamik des mitochondrialen DNA-Stoffwechsels (mtDNA) in Zellen unter Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats und automatisierter Immunfluoreszenzbildgebung zum Nachweis und zur Quantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung beschrieben. Dies kann weiter genutzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Belastungen und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die überwiegende Mehrheit der zellulären Prozesse erfordert eine kontinuierliche Energiezufuhr, deren häufigster Träger das ATP-Molekül ist. Eukaryotische Zellen produzieren den größten Teil ihres ATP in den Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung. Mitochondrien sind einzigartige Organellen, weil sie ein eigenes Genom haben, das repliziert und an die nächste Generation von Zellen weitergegeben wird. Im Gegensatz zum Kerngenom gibt es in der Zelle mehrere Kopien des mitochondrialen Genoms. Die detaillierte Untersuchung der Mechanismen, die für die Replikation, Reparatur und Aufrechterhaltung des mitochondrialen Genoms verantwortlich sind, ist unerlässlich, um das ordnungsgemäße Funktionieren von Mitochondrien und ganzen Zellen sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu verstehen. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Hochdurchsatzquantifizierung der Synthese und Verteilung von mitochondrialer DNA (mtDNA) in in vitro kultivierten humanen Zellen ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf der Immunfluoreszenzdetektion von aktiv synthetisierten DNA-Molekülen, die durch den Einbau von 5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU) markiert sind, und der gleichzeitigen Detektion aller mtDNA-Moleküle mit Anti-DNA-Antikörpern. Zusätzlich werden die Mitochondrien mit spezifischen Farbstoffen oder Antikörpern sichtbar gemacht. Die Kultivierung von Zellen im Multi-Well-Format und der Einsatz eines automatisierten Fluoreszenzmikroskops erleichtern es, die Dynamik der mtDNA und die Morphologie der Mitochondrien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen in relativ kurzer Zeit zu untersuchen.

Einleitung

Für die meisten eukaryotischen Zellen sind Mitochondrien essentielle Organellen, da sie eine entscheidende Rolle in zahlreichen zellulären Prozessen spielen. Mitochondrien sind in erster Linie die wichtigsten Energielieferanten der Zellen¹. Mitochondrien sind auch an der Regulierung der zellulären Homöostase (z. B. intrazelluläres Redox² und des Kalziumhaushalts³), der Zellsignalübertragung ^4,5, der Apoptose⁶, der Synthese verschiedener biochemischer Verbindungen ^7,8 und der angeborenen Immunantwort^{beteiligt 9}. Mitochondriale Dysfunktion wird mit verschiedenen pathologischen Zuständen und menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht¹⁰.

Die Funktion der Mitochondrien hängt von der genetischen Information ab, die sich in zwei getrennten Genomen befindet: dem Kern- und dem mitochondrialen Genom. Das mitochondriale Genom kodiert im Vergleich zum Kerngenom nur eine kleine Anzahl von Genen, aber alle mtDNA-kodierten Gene sind für das menschliche Leben unerlässlich. Die mitochondriale Proteinmaschinerie, die für die Aufrechterhaltung der mtDNA notwendig ist, wird von nDNA kodiert. Die grundlegenden Komponenten des mitochondrialen Replisoms sowie einige mitochondriale Biogenesefaktoren wurden bereits identifiziert (in früheren Forschungsarbeiten überprüft^11,12). Die mitochondrialen DNA-Replikations- und Erhaltungsmechanismen sind jedoch noch weit davon entfernt, verstanden zu werden. Im Gegensatz zur nDNA liegt das mitochondriale Genom in mehreren Kopien vor, was eine zusätzliche Schicht zur Regulierung der mitochondrialen Genexpression darstellt. Viel weniger ist derzeit über die Verteilung und Segregation von mtDNA innerhalb von Organellen bekannt, inwieweit diese Prozesse reguliert sind und wenn ja, welche Proteine beteiligt sind¹³. Das Segregationsmuster ist entscheidend, wenn Zellen eine gemischte Population aus Wildtyp- und mutierter mtDNA enthalten. Ihre ungleiche Verteilung kann zur Bildung von Zellen mit einer schädlichen Menge an mutierter mtDNA führen.

Bisher wurden die Proteinfaktoren, die für den Erhalt der mtDNA notwendig sind, vor allem durch biochemische Methoden, bioinformatische Analysen oder durch krankheitsassoziierte Studien identifiziert. Um eine hohe Wahrscheinlichkeit zu gewährleisten, Faktoren zu identifizieren, die sich bisher der Identifizierung entzogen haben, wird in dieser Arbeit eine andere Strategie beschrieben. Die Methode basiert auf der Markierung von mtDNA während der Replikation oder Reparatur mit 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU), einem Nukleosid-Analogon von Thymidin. BrdU wird während der DNA-Synthese leicht in entstehende DNA-Stränge eingebaut und im Allgemeinen zur Überwachung der Replikation von Kern-DNA^{verwendet 14}. Das hier entwickelte Verfahren wurde jedoch für den Nachweis von in mtDNA eingebautem BrdU unter Verwendung der Immunfluoreszenz von Anti-BrdU-Antikörpern optimiert.

Der Ansatz ermöglicht die Hochdurchsatzquantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung in humanen Zellen, die in vitro kultiviert wurden. Eine Hochdurchsatzstrategie ist notwendig, um Tests unter verschiedenen Versuchsbedingungen in relativ kurzer Zeit durchzuführen; Daher wird im Protokoll vorgeschlagen, ein Multi-Well-Format für die Zellkultivierung und automatisierte Fluoreszenzmikroskopie für die Bildgebung zu verwenden. Das Protokoll umfasst die Transfektion von humanen HeLa-Zellen mit einer siRNA-Bibliothek und die anschließende Überwachung der mtDNA-Replikation oder -Reparatur durch die metabolische Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU. Dieser Ansatz wird mit einer Immunfärbung der DNA mit Hilfe von Anti-DNA-Antikörpern kombiniert. Beide Parameter werden mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Zusätzlich werden Mitochondrien mit einem bestimmten Farbstoff sichtbar gemacht. Um die Spezifität des Protokolls zu demonstrieren, wurde die BrdU-Färbung an Zellen ohne mtDNA (rho0-Zellen), an HeLa-Zellen nach dem Silencing bekannter mtDNA-Erhaltungsfaktoren und an HeLa-Zellen nach Behandlung mit einem mtDNA-Replikationsinhibitor getestet. Die mtDNA-Konzentrationen wurden auch mit einer unabhängigen Methode, nämlich der qPCR, gemessen.

Protokoll

1. Herstellung der siRNA-Mischung

1. Einen Tag vor Beginn des Experiments werden Zellen (z.B. HeLa) auf einer 100-mm-Schale so ausgesät, dass sie am nächsten Tag eine 70%-90%-Konfluenz erreichen.
   Anmerkungen: Alle Operationen müssen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden.
2. Die entsprechende Menge siRNA wird auf eine Konzentration von 140 nM in Opti-MEM-Medium verdünnt (siehe Materialtabelle) hergestellt. Eine 96-Well-Platte kann als Reservoir verwendet werden.
3. Geben Sie 5 μl der siRNA-Lösung (oder des Opti-MEM-Mediums für die Kontrollproben) in jede Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte.
   HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der getesteten siRNA-Proben kann eine elektronische oder Mehrkanalpipette verwendet werden.
4. Bereiten Sie die entsprechende Menge RNAiMAX-Transfektionsreagenzlösung (siehe Materialtabelle) in Opti-MEM-Medium vor. Fügen Sie 1 μl RNAiMAX pro 100 μl Medium hinzu.
5. Geben Sie 10 μl der Transfektionsreagenzlösung in jede Vertiefung der 384-Well-Platte. Der bequemste und schnellste Weg, dies zu tun, ist mit einem Reagenzienspender.
6. Inkubieren Sie die siRNA mit dem Transfektionsreagenz für 30 min bei Raumtemperatur.

2. Vorbereitung der Zellen für die Transfektion

1. Während der Inkubation (Schritt 1.6) wird das Medium mit einer Absaugvorrichtung angesaugt (siehe Materialtabelle) und die Zellen mit 3 ml PBS gewaschen.
2. Fügen Sie 1,5 ml Trypsin hinzu, das 1:2 in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 10 Minuten.
3. Überprüfen Sie, ob sich die Zellen gelöst haben. Wenn dies der Fall ist, fügen Sie 3 ml DMEM-Medium mit 10 % FBS hinzu. Suspendieren Sie die Zellen gründlich und übertragen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Nehmen Sie mindestens 150 μl der Suspension und zählen Sie die Zellen in einer Zellzählkammer (siehe Materialtabelle).
4. Bereiten Sie eine Zellsuspension in der entsprechenden Konzentration (35.000/ml für die HeLa-Linie) in DMEM-Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin vor.

3. Zelltransfektion

1. Geben Sie 20 μl der Zellsuspension mit dem Reagenziendispenser in jede Vertiefung der 384-Well-Platte. Dies führt dazu, dass pro Well 700 Zellen ausgesät werden.
2. Inkubieren Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur und legen Sie sie dann für 72 h (37 °C und 5 % CO₂) in den Inkubator.

4. Gründung der BrdU

1. Bereiten Sie eine 90-μM-Lösung von BrdU (siehe Materialtabelle) in DMEM-Medium mit 10 % FBS vor.
2. 56 h nach der siRNA-Transfektion (16 h vor der Zellfixierung) werden 10 μl 90 μM BrdU-Lösung in jede Vertiefung der 384-Well-Platte gegeben (die endgültige BrdU-Konzentration beträgt 20 μM).
   HINWEIS: Die Aktion sollte so schnell wie möglich ausgeführt werden. Daher ist es am besten, einen Reagenziendispenser, eine elektronische Pipette oder eine Multi-Dispenser-Pipette zu verwenden. Denken Sie daran, Kontrollbohrungen ohne Zusatz von BrdU vorzubereiten.
3. Inkubieren Sie die Zellen für 16 h (37 °C und 5 % CO₂).

5. Markierung von Mitochondrien

1. Bereiten Sie eine 20 μM Lösung von BrdU in DMEM mit 10 % FBS vor und fügen Sie ihr die Mitochondrien-Tracking-Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) bis zu einer Konzentration von 1,1 μM hinzu.
2. 15 h nach Beginn der BrdU-Inkorporation (1 h vor der Zellfixierung) werden 10 μl der Mitochondrien-Tracking-Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung der 384-Well-Platte gegeben (die endgültige Farbstoffkonzentration beträgt 200 nM).
   Anmerkungen: Verwenden Sie einen Reagenziendispenser, eine elektronische Pipette oder eine Multi-Dispenser-Pipette. Denken Sie daran, Kontrollvertiefungen ohne Zusatz von BrdU, aber mit Zugabe des Mitochondrien-Tracking-Farbstoffs beizubehalten.
3. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h (37 °C und 5 % CO₂).

6. Fixierung der Zellen

Anmerkungen: Das Waschen erfolgt am bequemsten mit einem Mikrotiterplattenreiniger, während die Zugabe von Reagenzien am schnellsten mit einem Reagenzienspender erfolgt.

1. Spülen Sie mit dem Mikrotiterplatten-Washer (siehe Materialtabelle) jeweils zweimal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach dem zweiten Waschen 25 μl PBS in der Vertiefung.
   HINWEIS: Wenn PBS in der Vertiefung verbleibt, verringert sich die Wahrscheinlichkeit einer Zellablösung während der Zugabe von Flüssigkeit im nächsten Schritt. Alle Wäschen werden mit dem PBS abgeschlossen; Daher sollte die im nächsten Schritt hinzugefügte Lösung immer in einer 2-fachen Konzentration hergestellt werden, da sie in gleichem Volumen zum verbleibenden PBS hinzugefügt wird.
2. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 25 μl einer 8%igen Formaldehydlösung in PBS mit 0,4% Triton X-100 und Hoechst 33342 bei einer Konzentration von 4 μg/ml (die Endkonzentrationen der einzelnen Reagenzien betragen 4 %, 0,2 % bzw. 2 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
3. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

7. Sperrung

1. Spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach der letzten Wäsche 25 μl PBS in der Welle.
2. Geben Sie 25 μl 6 % BSA in PBS (die endgültige BSA-Konzentration beträgt 3 %) in jede Vertiefung.
3. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

8. Zugabe der Primärantikörper

1. Aspirieren Sie die BSA mit einem Mikrotiterplatten-Washer und lassen Sie 10 μl Lösung in der Vertiefung.
2. Fügen Sie 10 μl der primären Antikörperlösung hinzu, die in 3 % BSA in PBS hergestellt wurde. Anti-BrdU mit 0,8 μg/ml und Anti-DNA mit 0,4 μg/ml (die Endkonzentrationen der Antikörper betragen 0,4 μg/ml bzw. 0,2 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
3. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 4 °C über Nacht.

9. Zugabe der Sekundärantikörper

1. Spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach dem letzten Waschen 10 μl PBS in der Vertiefung.
2. Fügen Sie 10 μl der 4 μg/ml Sekundärantikörperlösung hinzu, die in 6 % BSA in PBS hergestellt wurde (die Endkonzentration beträgt 2 μg/ml). Verwenden Sie isotypspezifische Antikörper (Anti-Maus-IgG1 und Anti-Maus-IgM), die an Fluorochrome wie Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 555 konjugiert sind (siehe Materialtabelle).
3. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 h.
4. Spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach dem letzten Waschen 50 μl PBS in der Vertiefung.
5. Verschließen Sie die Platte mit einer selbstklebenden Siegelfolie (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie im Dunkeln bei 4 °C. Die Bildgebung muss innerhalb von 2 Wochen durchgeführt werden.

10. Bildgebung

HINWEIS: Die Bildgebung muss mit einem automatisierten Weitfeldmikroskop durchgeführt werden. Das Mikroskop muss mit einem Motortisch ausgestattet sein, der mit Bedienelementen ausgestattet ist, um einzelne Bereiche der Platte automatisch abzubilden.

1. Überprüfen Sie die Autofokuseinstellungen in den Eckbereichen der Platte (Vertiefungen A1, A24, P24, P1) und in der Mitte.
   HINWEIS: Für die Bildgebung wird empfohlen, ein 20-faches Objektiv mit kurzem Arbeitsabstand (siehe Materialtabelle) mit der höchstmöglichen numerischen Apertur zu verwenden.
2. Wählen Sie anhand der von der Bildgebungssoftware im Live-View-Modus erzeugten Intensitätshistogramme eine ausreichend lange Belichtungszeit für die einzelnen Fluoreszenzkanäle, damit das resultierende Bild nicht übersättigt wird.
3. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Ebenen für die Bildgebung auf der z-Achse fest.
   HINWEIS: Das Sichtfeld bei 20-facher Vergrößerung ist groß genug, dass sich nicht alle Zellen in derselben Fokusebene befinden, daher muss ein Z-Schnitt durchgeführt werden, um alle Zellen in ihrer richtigen Fokusebene anzuzeigen. In der Regel reichen fünf Flugzeuge aus. Je nach verfügbarem Speicherplatz können einzelne Z-Stapel oder nur Projektionen der maximalen Intensität gespeichert werden. Die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" gezeigte Bildanalyse basiert auf Projektionen der maximalen Intensität.
4. Wählen Sie die entsprechende Anzahl von Sichtfeldern aus, die pro Vertiefung angezeigt werden sollen.
   HINWEIS: Je nach Konfluenz können ca. 60-300 Zellen in einem Sichtfeld abgebildet werden. In der Regel können HeLa-Zellen mit einer Konfluenz von 60 % bis 90 % durch die Abbildung von fünf Sichtfeldern von 500 Zellen bis über 1.000 Zellen analysiert werden.
5. Wählen Sie die Wells aus, die abgebildet werden sollen, und starten Sie die Bildgebung.

11. Quantitative Bildanalyse

HINWEIS: Die quantitative Analyse der aufgenommenen Bilder kann mit einer Open-Source-Software wie Cell Profiler¹⁵ durchgeführt werden. Für die vorliegende Studie wurde die Analyse mit der Software ScanR 3.0.0 durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie eine Hintergrundkorrektur für alle Bilder aus allen Fluoreszenzkanälen durchführen. Wählen Sie je nach Größe der analysierten Objekte die passende Filtergröße: 80 Pixel für Zellkerne und 4 Pixel für BrdU- und mtDNA-Spots.
2. Beginnen Sie mit der Segmentierung des Bildes, indem Sie eine Maske des Hauptobjekts erstellen, die auf dem Verhältnis der Intensität des Fluoreszenzsignals zum Hintergrund für den Kanal basiert, der den Zellkernen entspricht.
3. Erstellen Sie Masken für die Unterobjekte, die die BrdU- bzw. mtDNA-Punkte darstellen, indem Sie die für die gegebenen Strukturen geeigneten Fluoreszenzkanäle verwenden.
   HINWEIS: Jedes Unterobjekt ist dem nächstgelegenen Hauptobjekt (Zellkern) zugeordnet.
4. Legen Sie die Parameter fest, die während der Analyse gemessen werden sollen, und messen Sie die Intensität der einzelnen Pixel innerhalb jeder Maske für alle Fluoreszenzkanäle.
   HINWEIS: Es ist auch notwendig, die Anzahl der Unterobjekte zu berechnen, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind, und die Fläche jedes Unterobjekts.
5. Definieren Sie die abgeleiteten Parameter, die auf der Grundlage der erhaltenen Daten berechnet werden sollen. Um die Gesamtfluoreszenzintensitäten für den BrdU- oder mtDNA-Kanal zu erhalten, summieren Sie die Intensitäten aller Unterobjekte, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind. Um die mittlere Fluoreszenzintensität zu erhalten, dividieren Sie die Gesamtfluoreszenzintensität durch die Summe der Fläche der Unterobjekte, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass sich das erstellte Unterobjekt (BrdU- oder mtDNA-Spot) tatsächlich in den Mitochondrien befindet, ist es notwendig, sie basierend auf der Fluoreszenzintensität des Mitochondrien-Tracking-Farbstoffs zu gaten.
6. Führen Sie eine weitere Analyse der mit der ScanR-Software erhaltenen Daten mit der Statistiksoftware R 4.2.2¹⁶ zusammen mit den folgenden Paketen durch: dplyr 17, data.table¹⁸, ggplot2¹⁹ und ggpubr²⁰. Dieser Schritt ist optional.

Ergebnisse

Ein Schema des Verfahrens für die Hochdurchsatzuntersuchung der Dynamik der mtDNA-Synthese und -Verteilung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats ermöglicht die gleichzeitige Analyse vieler verschiedener experimenteller Bedingungen, wie z.B. das Silencing verschiedener Gene mit Hilfe einer siRNA-Bibliothek. Die Bedingungen, die für die Markierung neu synthetisierter DNA-Moleküle mit BrdU verwendet werden, ermöglichen den Nachweis von BrdU-markiert...

Diskussion

In der Vergangenheit wurde die DNA-Markierung durch BrdU-Einbau und Antikörpernachweis in der nukleären DNA-Replikation und Zellzyklusforschung eingesetzt 14,27,28. Bisher enthielten alle Protokolle zum Nachweis von BrdU-markierter DNA einen DNA-Denaturierungsschritt (sauer oder thermisch) oder einen Enzymverdau (DNase oder Proteinase), um die Epitopexposition zu ermöglichen und das Eindringen von Antikörpern zu erleichtern....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus