Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

Resumo

Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.

Resumo

A grande maioria dos processos celulares requer um fornecimento contínuo de energia, cujo portador mais comum é a molécula de ATP. As células eucarióticas produzem a maior parte de seu ATP nas mitocôndrias por fosforilação oxidativa. As mitocôndrias são organelas únicas porque têm seu próprio genoma que é replicado e transmitido para a próxima geração de células. Em contraste com o genoma nuclear, existem múltiplas cópias do genoma mitocondrial na célula. O estudo detalhado dos mecanismos responsáveis pela replicação, reparo e manutenção do genoma mitocondrial é essencial para a compreensão do bom funcionamento das mitocôndrias e das células inteiras em condições normais e de doença. Aqui, um método que permite a quantificação em alto rendimento da síntese e distribuição de DNA mitocondrial (mtDNA) em células humanas cultivadas in vitro é apresentado. Esta abordagem é baseada na detecção por imunofluorescência de moléculas de DNA ativamente sintetizadas marcadas pela incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) e na detecção concomitante de todas as moléculas de mtDNA com anticorpos anti-DNA. Além disso, as mitocôndrias são visualizadas com corantes ou anticorpos específicos. O cultivo de células em formato multipoço e o uso de um microscópio automatizado de fluorescência facilitam o estudo da dinâmica do mtDNA e da morfologia das mitocôndrias sob uma variedade de condições experimentais em um tempo relativamente curto.

Introdução

Para a maioria das células eucarióticas, as mitocôndrias são organelas essenciais, pois desempenham um papel crucial em inúmeros processos celulares. Em primeiro lugar, as mitocôndrias são os principais fornecedores de energia das células¹. As mitocôndrias também estão envolvidas na regulação da homeostase celular (por exemplo, redox^{intracelular 2} e balanço de cálcio³), sinalização celular^4,5, apoptose⁶, síntese de diferentes compostos bioquímicos ^7,8 e resposta imune inata⁹. A disfunção mitocondrial está associada a vários estados patológicos e doenças humanas¹⁰.

O funcionamento das mitocôndrias depende da informação genética localizada em dois genomas separados: o genoma nuclear e o genoma mitocondrial. O genoma mitocondrial codifica um pequeno número de genes em comparação com o genoma nuclear, mas todos os genes codificados pelo mtDNA são essenciais para a vida humana. A maquinaria de proteínas mitocondriais necessária para manter o mtDNA é codificada por nDNA. Os componentes básicos do replissoma mitocondrial, bem como alguns fatores da biogênese mitocondrial, já foram identificados (revisado em pesquisa^{anterior11,12}). No entanto, os mecanismos de replicação e manutenção do DNA mitocondrial ainda estão longe de serem compreendidos. Em contraste com o nDNA, o genoma mitocondrial existe em múltiplas cópias, o que fornece uma camada adicional para regular a expressão gênica mitocondrial. Muito menos se sabe atualmente sobre a distribuição e segregação do mtDNA dentro de organelas, em que medida esses processos são regulados e, se são, quais proteínas estão envolvidas¹³. O padrão de segregação é crucial quando as células contêm uma população mista de mtDNA selvagem e mutado. Sua distribuição desigual pode levar à geração de células com uma quantidade prejudicial de mtDNA mutado.

Até o momento, os fatores proteicos necessários para a manutenção do mtDNA têm sido identificados principalmente por métodos bioquímicos, análises bioinformáticas ou estudos associados a doenças. Neste trabalho, a fim de garantir uma alta chance de identificar fatores que escaparam previamente à identificação, uma estratégia diferente é descrita. O método é baseado na marcação do mtDNA durante replicação ou reparo com 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), um análogo nucleosídeo da timidina. O BrdU é prontamente incorporado em fitas de DNA nascentes durante a síntese de DNA e, em geral, é usado para monitorar a replicação do DNA nuclear¹⁴. No entanto, o procedimento aqui desenvolvido foi otimizado para detectar BrdU incorporado ao mtDNA usando a imunofluorescência de anticorpos anti-BrdU.

A abordagem permite a quantificação em alto rendimento da síntese e distribuição do mtDNA em células humanas cultivadas in vitro. Uma estratégia de alto rendimento é necessária para conduzir testes sob diferentes condições experimentais em um tempo relativamente curto; Portanto, propõe-se no protocolo a utilização de um formato multipoço para cultura celular e microscopia de fluorescência automatizada para obtenção de imagens. O protocolo inclui a transfecção de células HeLa humanas com uma biblioteca de siRNA e o monitoramento subsequente da replicação ou reparo do mtDNA usando a marcação metabólica do DNA recém-sintetizado com BrdU. Essa abordagem é combinada com a imunomarcação do DNA com a ajuda de anticorpos anti-DNA. Ambos os parâmetros são analisados por microscopia quantitativa de fluorescência. Além disso, as mitocôndrias são visualizadas com um corante específico. Para demonstrar a especificidade do protocolo, a coloração BrdU foi testada em células desprovidas de mtDNA (células rho0), em células HeLa após o silenciamento de fatores de manutenção bem conhecidos do mtDNA e em células HeLa após tratamento com um inibidor de replicação do mtDNA. Os níveis de mtDNA também foram medidos por um método independente, a qPCR.

Protocolo

1. Preparação da mistura de siRNA

1. Um dia antes do início do experimento, as células de sementes (por exemplo, HeLa) em uma placa de 100 mm para que atinjam 70%-90% de confluência no dia seguinte.
   NOTA: Todas as operações devem ser realizadas em condições estéreis em uma câmara de fluxo laminar.
2. Preparar a quantidade adequada de siRNA diluído a uma concentração de 140 nM em meio Opti-MEM (ver Tabela de Materiais). Uma placa de 96 poços pode ser usada como reservatório.
3. Adicionar 5 μL da solução de siRNA (ou meio Opti-MEM para as amostras de controle) a cada poço de uma microplaca preta de cultura celular de 384 poços.
   NOTA: Dependendo do número de amostras de siRNA testadas, uma pipeta eletrônica ou multicanal pode ser usada.
4. Preparar a quantidade adequada de solução reagente de transfecção RNAiMAX (ver Tabela de Materiais) em meio Opti-MEM. Adicionar 1 μL de RNAiMAX para cada 100 μL de meio.
5. Adicionar 10 μL da solução reagente de transfecção a cada poço da placa de 384 poços. A maneira mais conveniente e rápida de fazer isso é com um dispensador de reagentes.
6. Incubar o siRNA com o reagente de transfecção por 30 min à temperatura ambiente.

2. Preparação das células para transfecção

1. Durante a incubação (passo 1.6), aspirar o meio com um dispositivo de sucção (ver Tabela de Materiais) e lavar as células com 3 ml de PBS.
2. Adicionar 1,5 ml de tripsina diluída 1:2 em PBS e incubar as células a 37 °C durante 10 minutos.
3. Verifique se as células se destacaram; em caso afirmativo, adicionar 3 mL de meio DMEM com FBS a 10%. Suspender completamente as células e transferi-las para um tubo de 15 mL. Tome pelo menos 150 μL da suspensão e conte as células numa câmara de contagem de células (ver Tabela de Materiais).
4. Preparar uma suspensão celular na concentração apropriada (35.000/mL para a linha HeLa) em meio DMEM com SFB a 10%, penicilina e estreptomicina.

3. Transfecção celular

1. Adicionar 20 μL da suspensão celular a cada poço da placa de 384 poços usando o dispensador de reagentes. Isso resultará em 700 células semeadas por poço.
2. Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, colocá-las na incubadora durante 72 h (37 °C e 5% CO₂).

4. Incorporação do BrdU

1. Preparar uma solução de 90 μM de BrdU (ver Tabela de Materiais) em meio DMEM com FBS a 10%.
2. Em 56 h após a transfecção do siRNA (16 h antes da fixação celular), adicionar 10 μL de solução de BrdU 90 μM a cada poço da placa de 384 poços (a concentração final de BrdU é de 20 μM).
   OBS: A ação deve ser executada o mais rápido possível; Portanto, é melhor usar um dispensador de reagentes, pipeta eletrônica ou pipeta multidispensador. Lembre-se de preparar poços de controle sem a adição de BrdU.
3. Incubar as células durante 16 h (37 °C e 5% CO₂).

5. Marcação de mitocôndrias

1. Preparar uma solução de 20 μM de BrdU em DMEM com FBS a 10% e adicionar a solução corante de rastreamento de mitocôndrias (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 1,1 μM.
2. Às 15 h após o início da incorporação de BrdU (1 h antes da fixação celular), adicione 10 μL da solução de corante rastreador de mitocôndrias (ver Tabela de Materiais) a cada poço da placa de 384 poços (a concentração final do corante é de 200 nM).
   NOTA: Use um dispensador de reagentes, pipeta eletrônica ou pipeta multidispensador. Lembre-se de manter os poços de controle sem a adição de BrdU, mas com a adição do corante rastreador de mitocôndrias.
3. Incubar as células durante 1 h (37 °C e 5% CO₂).

6. Fixação celular

NOTA: Toda a lavagem é mais convenientemente realizada usando uma lavadora de microplacas, enquanto a adição de reagentes é realizada mais rapidamente usando um dispensador de reagentes.

1. Usando a lavadora de microplacas (ver Tabela de Materiais), enxágue cada poço duas vezes com 100 μL de PBS. Após a segunda lavagem, deixar 25 μL de PBS no poço.
   NOTA: Deixar PBS no poço reduz a probabilidade de desprendimento celular durante a adição de líquido na próxima etapa. Todas as lavagens são concluídas com o PBS deixado; portanto, a solução adicionada na próxima etapa deve ser sempre preparada em uma concentração de 2x, pois será adicionada em um volume igual ao PBS restante.
2. Corrigir as células adicionando 25 μL de uma solução de formaldeído a 8% em PBS com Triton X-100 a 0,4% e Hoechst 33342 a uma concentração de 4 μg/mL (as concentrações finais de reagentes individuais são de 4%, 0,2% e 2 μg/mL, respectivamente) (ver Tabela de Materiais).
3. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos.

7. Bloqueio

1. Enxaguar cada poço quatro vezes com 100 μL de PBS. Após a última lavagem, deixar 25 μL de PBS no poço.
2. Adicionar 25 μL de BSA a 6% em PBS (a concentração final de BSA é de 3%) a cada poço.
3. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos.

8. Adição dos anticorpos primários

1. Aspirar a BSA usando uma arruela de microplacas e deixar 10 μL de solução no poço.
2. Adicionar 10 μL da solução de anticorpos primários preparada em BSA a 3% em PBS. Use anti-BrdU a 0,8 μg/mL e anti-DNA a 0,4 μg/mL (as concentrações finais de anticorpos são 0,4 μg/mL e 0,2 μg/mL, respectivamente) (ver Tabela de Materiais).
3. Incubar a placa no escuro a 4 °C durante a noite.

9. Adição dos anticorpos secundários

1. Enxaguar cada poço quatro vezes com 100 μL de PBS. Após a última lavagem, deixe 10 μL de PBS no poço.
2. Adicionar 10 μL da solução de anticorpos secundários de 4 μg/mL preparada em BSA a 6% em PBS (a concentração final é de 2 μg/mL). Use anticorpos isotipo-específicos (IgG1 anti-camundongo e IgM anti-camundongo) conjugados a fluorocromos como Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555 (consulte a Tabela de Materiais).
3. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 1 h.
4. Enxaguar cada poço quatro vezes com 100 μL de PBS. Após a última lavagem, deixe 50 μL de PBS no poço.
5. Selar a placa com uma película de vedação adesiva (ver Tabela de Materiais) e guardá-la no escuro a 4 °C. Os exames de imagem devem ser realizados dentro de 2 semanas.

10. Exames por imagem

NOTA: As imagens devem ser realizadas com um microscópio de campo largo automatizado; O microscópio deve estar equipado com um estágio motor fornecido com comandos para obter imagens automáticas de áreas individuais da placa.

1. Verifique as configurações de foco automático nas áreas de canto da placa (poços A1, A24, P24, P1) e no centro.
   NOTA: Para aquisição de imagens, recomenda-se o uso de uma objetiva de curta distância de trabalho de 20x (consulte Tabela de Materiais) com a maior abertura numérica possível.
2. Com base nos histogramas de intensidade gerados pelo software de imagem no modo de visualização ao vivo, selecione um tempo de exposição suficientemente longo para os canais de fluorescência individuais para que a imagem resultante não fique saturada demais.
3. Defina o número apropriado de planos para geração de imagens no eixo z.
   Observação : o campo de visão em ampliação de 20x é grande o suficiente para que nem todas as células estão no mesmo plano de foco, portanto, z-seccionamento deve ser executado para exibir todas as células em seu plano correto de foco. Normalmente, cinco aviões são suficientes. Dependendo da disponibilidade de espaço em disco, z-stacks individuais ou apenas projeções de intensidade máxima podem ser salvas. A análise das imagens mostradas na seção de resultados representativos é baseada em projeções de intensidade máxima.
4. Selecione o número apropriado de campos de exibição a serem exibidos por poço.
   Observação : dependendo da confluência, aproximadamente 60-300 células podem ser imageadas em um campo de visão. Normalmente, para células HeLa com uma confluência de 60%-90%, a obtenção de imagens de cinco campos de visão permitirá analisar de 500 células a mais de 1.000 células.
5. Selecione os poços a serem fotografados e inicie a geração de imagens.

11. Análise quantitativa de imagens

NOTA: A análise quantitativa das imagens adquiridas pode ser realizada utilizando um software de código aberto como o Cell Profiler¹⁵. Para o presente estudo, a análise foi realizada utilizando-se o software ScanR 3.0.0 (vide Tabela de Materiais).

1. Inicie a análise realizando a correção de fundo para todas as imagens de todos os canais de fluorescência. Dependendo do tamanho dos objetos analisados, selecione o tamanho apropriado do filtro: 80 pixels para núcleos celulares e 4 pixels para pontos de BrdU e mtDNA.
2. Comece a segmentar a imagem criando uma máscara do objeto principal com base na razão entre a intensidade do sinal de fluorescência e o fundo do canal correspondente aos núcleos celulares.
3. Crie máscaras para os sub-objetos que representam os pontos BrdU e mtDNA, respectivamente, usando os canais de fluorescência apropriados para as estruturas dadas.
   Observação : cada sub-objeto é atribuído ao objeto principal mais próximo (núcleo da célula).
4. Defina os parâmetros a serem medidos durante a análise e meça a intensidade dos pixels individuais dentro de cada máscara para todos os canais de fluorescência.
   NOTA: Também é necessário calcular o número de sub-objetos atribuídos a um determinado núcleo celular e a área de cada sub-objeto.
5. Defina os parâmetros derivados a serem calculados com base nos dados obtidos. Para obter as intensidades totais de fluorescência para o canal BrdU ou mtDNA, somar as intensidades de todos os sub-objetos atribuídos a um dado núcleo celular. Para obter a intensidade média de fluorescência, divida a intensidade total de fluorescência pela soma da área dos subobjetos atribuídos a um dado núcleo celular.
   NOTA: Para garantir que o sub-objeto criado (BrdU ou ponto de mtDNA) esteja realmente localizado nas mitocôndrias, é necessário portá-las com base na intensidade de fluorescência do corante de rastreamento de mitocôndrias.
6. Realizar uma análise mais aprofundada dos dados obtidos com o software ScanR utilizando o software estatístico R 4.2.2¹⁶ juntamente com os seguintes pacotes: dplyr 17, data.table 18, ggplot2¹⁹ e ggpubr²⁰. Esta etapa é opcional.

Resultados

Um esquema do procedimento para o estudo de alto rendimento da dinâmica da síntese e distribuição do mtDNA é mostrado na Figura 1. O uso de um formato de placa multipoço permite a análise simultânea de muitas condições experimentais diferentes, como o silenciamento de diferentes genes usando uma biblioteca de siRNAs. As condições usadas para a marcação de moléculas de DNA recém-sintetizadas com BrdU permitem a detecção de DNA marcado com BrdU nas mitocôndrias de células H...

Discussão

Historicamente, a marcação de DNA por incorporação de BrdU e detecção de anticorpos tem sido utilizada na replicação de DNA nuclear e na pesquisa do ciclo celular 14,27,28. Até agora, todos os protocolos para detecção de DNA marcado com BrdU incluíram uma etapa de desnaturação do DNA (ácida ou térmica) ou digestão enzimática (DNase ou proteinase) para permitir a exposição de epítopos e facilitar a penetraç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus