Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

Résumé

Une procédure d’étude de la dynamique du métabolisme de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules à l’aide d’un format de plaque multipuits et d’une imagerie automatisée par immunofluorescence pour détecter et quantifier la synthèse et la distribution de l’ADNmt est décrite. Cela peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt.

Résumé

La grande majorité des processus cellulaires nécessitent un apport continu d’énergie, dont le porteur le plus courant est la molécule d’ATP. Les cellules eucaryotes produisent la majeure partie de leur ATP dans les mitochondries par phosphorylation oxydative. Les mitochondries sont des organites uniques parce qu’elles ont leur propre génome qui est répliqué et transmis à la génération suivante de cellules. Contrairement au génome nucléaire, il existe plusieurs copies du génome mitochondrial dans la cellule. L’étude détaillée des mécanismes responsables de la réplication, de la réparation et du maintien du génome mitochondrial est essentielle pour comprendre le bon fonctionnement des mitochondries et des cellules entières dans des conditions normales et pathologiques. Ici, une méthode qui permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules humaines cultivées in vitro est présentée. Cette approche est basée sur la détection par immunofluorescence de molécules d’ADN synthétisées activement marquées par incorporation de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) et la détection simultanée de toutes les molécules d’ADNmt avec des anticorps anti-ADN. De plus, les mitochondries sont visualisées avec des colorants ou des anticorps spécifiques. La culture de cellules dans un format multipuits et l’utilisation d’un microscope à fluorescence automatisé facilitent l’étude de la dynamique de l’ADNmt et de la morphologie des mitochondries dans diverses conditions expérimentales dans un temps relativement court.

Introduction

Pour la plupart des cellules eucaryotes, les mitochondries sont des organites essentiels, car elles jouent un rôle crucial dans de nombreux processus cellulaires. Tout d’abord, les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’énergie des cellules¹. Les mitochondries sont également impliquées dans la régulation de l’homéostasie cellulaire (par exemple, l’oxydox^{intracellulaire 2} et l’équilibre calcique³), la signalisation cellulaire^4,5, l’apoptose ⁶, la synthèse de différents composés biochimiques ^7,8 et la réponse immunitaire innée⁹. Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à divers états pathologiques et maladies humaines¹⁰.

Le fonctionnement des mitochondries dépend de l’information génétique située dans deux génomes distincts : le génome nucléaire et le génome mitochondrial. Le génome mitochondrial code un petit nombre de gènes par rapport au génome nucléaire, mais tous les gènes codés par l’ADNmt sont essentiels à la vie humaine. La machinerie protéique mitochondriale nécessaire au maintien de l’ADNmt est codée par l’ADNn. Les composants de base du réplisome mitochondrial, ainsi que certains facteurs de biogenèse mitochondriale, ont déjà été identifiés (examinés dans des recherches antérieures^11,12). Cependant, les mécanismes de réplication et de maintien de l’ADN mitochondrial sont encore loin d’être compris. Contrairement à l’ADNn, le génome mitochondrial existe en plusieurs copies, ce qui fournit une couche supplémentaire pour réguler l’expression des gènes mitochondriaux. On en sait beaucoup moins actuellement sur la distribution et la ségrégation de l’ADNmt au sein des organites, dans quelle mesure ces processus sont régulés et, le cas échéant, quelles protéines sont impliquées¹³. Le schéma de ségrégation est crucial lorsque les cellules contiennent une population mixte d’ADNmt de type sauvage et muté. Leur distribution inégale peut conduire à la génération de cellules avec une quantité néfaste d’ADNmt muté.

Jusqu’à présent, les facteurs protéiques nécessaires au maintien de l’ADNmt ont été identifiés principalement par des méthodes biochimiques, des analyses bioinformatiques ou par des études associées à la maladie. Dans ce travail, afin d’assurer une forte chance d’identifier les facteurs qui ont précédemment échappé à l’identification, une stratégie différente est décrite. La méthode est basée sur le marquage de l’ADNmt pendant la réplication ou la réparation avec la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU), un analogue nucléosidique de la thymidine. BrdU est facilement incorporé dans les brins d’ADN naissants lors de la synthèse de l’ADN et, en général, est utilisé pour surveiller la réplication de l’ADN nucléaire¹⁴. Cependant, la procédure développée ici a été optimisée pour détecter BrdU incorporé dans l’ADNmt en utilisant l’immunofluorescence des anticorps anti-BrdU.

L’approche permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt dans des cellules humaines cultivées in vitro. Une stratégie à haut débit est nécessaire pour effectuer des essais dans différentes conditions expérimentales dans un temps relativement court; Par conséquent, il est proposé dans le protocole d’utiliser un format multipuits pour la culture cellulaire et la microscopie à fluorescence automatisée pour l’imagerie. Le protocole comprend la transfection de cellules HeLa humaines avec une bibliothèque de siRNA et la surveillance ultérieure de la réplication ou de la réparation de l’ADNmt à l’aide du marquage métabolique de l’ADN nouvellement synthétisé avec BrdU. Cette approche est combinée avec l’immunomarquage de l’ADN à l’aide d’anticorps anti-ADN. Les deux paramètres sont analysés à l’aide de la microscopie quantitative à fluorescence. De plus, les mitochondries sont visualisées avec un colorant spécifique. Pour démontrer la spécificité du protocole, la coloration BrdU a été testée sur des cellules dépourvues d’ADNmt (cellules rho0), sur des cellules HeLa lors du silençage de facteurs de maintenance de l’ADNmt bien connus et sur des cellules HeLa après traitement avec un inhibiteur de la réplication de l’ADNmt. Les niveaux d’ADNmt ont également été mesurés par une méthode indépendante, à savoir la qPCR.

Protocole

1. Préparation du mélange siRNA

1. Un jour avant le début de l’expérience, les cellules de graines (par exemple, HeLa) sur une boîte de 100 mm afin qu’elles atteignent 70% à 90% de confluence le lendemain.
   NOTE: Toutes les opérations doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire.
2. Préparer la quantité appropriée de siRNA diluée à une concentration de 140 nM dans un milieu Opti-MEM (voir tableau des matériaux). Une plaque de 96 puits peut être utilisée comme réservoir.
3. Ajouter 5 μL de la solution siRNA (ou du milieu Opti-MEM pour les échantillons témoins) à chaque puits d’une microplaque de culture cellulaire noire de 384 puits.
   REMARQUE: Selon le nombre d’échantillons de siRNA testés, une pipette électronique ou multicanal peut être utilisée.
4. Préparer la quantité appropriée de solution de réactif de transfection RNAiMAX (voir tableau des matériaux) dans le milieu Opti-MEM. Ajouter 1 μL d’ARNiMAX pour chaque 100 μL de milieu.
5. Ajouter 10 μL de la solution de réactif de transfection à chaque puits de la plaque de 384 puits. Le moyen le plus pratique et le plus rapide de le faire est d’utiliser un distributeur de réactifs.
6. Incuber le siRNA avec le réactif de transfection pendant 30 min à température ambiante.

2. Préparation des cellules pour la transfection

1. Pendant l’incubation (étape 1.6), aspirer le milieu à l’aide d’un dispositif d’aspiration (voir le tableau des matières) et laver les cellules avec 3 mL de PBS.
2. Ajouter 1,5 mL de trypsine diluée 1:2 dans du PBS et incuber les cellules à 37 °C pendant 10 min.
3. Vérifiez si les cellules se sont détachées; si c’est le cas, ajouter 3 mL de milieu DMEM avec 10% FBS. Suspendez soigneusement les cellules et transférez-les dans un tube de 15 mL. Prélevez au moins 150 μL de la suspension et comptez les cellules dans une chambre de comptage des cellules (voir le tableau des matériaux).
4. Préparer une suspension cellulaire à la concentration appropriée (35 000/mL pour la lignée HeLa) dans un milieu DMEM avec 10 % de FBS, de pénicilline et de streptomycine.

3. Transfection cellulaire

1. Ajouter 20 μL de la suspension cellulaire à chaque puits de la plaque de 384 puits à l’aide du distributeur de réactif. Cela se traduira par 700 cellules ensemencées par puits.
2. Incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante, puis les placer dans l’incubateur pendant 72 h (37 °C et 5% CO₂).

4. Constitution BrdU

1. Préparer une solution 90 μM de BrdU (voir tableau des matériaux) en milieu DMEM avec 10% de FBS.
2. 56 h après la transfection du siRNA (16 h avant la fixation de la cellule), ajouter 10 μL de solution BrdU à 90 μM à chaque puits de la plaque de 384 puits (la concentration finale de BrdU est de 20 μM).
   REMARQUE: L’action doit être effectuée aussi rapidement que possible; Par conséquent, il est préférable d’utiliser un distributeur de réactifs, une pipette électronique ou une pipette multi-distributeur. N’oubliez pas de préparer les puits de contrôle sans ajout de BrdU.
3. Incuber les cellules pendant 16 h (37 °C et 5% de CO₂).

5. Étiquetage des mitochondries

1. Préparer une solution 20 μM de BrdU dans du DMEM avec 10% de FBS, et y ajouter la solution de colorant de suivi des mitochondries (voir Tableau des matériaux) à une concentration de 1,1 μM.
2. 15 h après le début de l’incorporation du BrdU (1 h avant la fixation cellulaire), ajouter 10 μL de la solution de colorant de suivi des mitochondries (voir le tableau des matériaux) à chaque puits de la plaque de 384 puits (la concentration finale du colorant est de 200 nM).
   REMARQUE: Utilisez un distributeur de réactif, une pipette électronique ou une pipette multi-distributeur. N’oubliez pas de conserver les puits de contrôle sans l’ajout de BrdU mais avec l’ajout du colorant de suivi des mitochondries.
3. Incuber les cellules pendant 1 h (37 °C et 5% de CO₂).

6. Fixation cellulaire

REMARQUE: Tout le lavage est effectué plus commodément à l’aide d’une laveuse de microplaques, tandis que l’ajout de réactifs est effectué plus rapidement à l’aide d’un distributeur de réactifs.

1. À l’aide de la laveuse à microplaques (voir le tableau des matières), rincer chaque puits deux fois avec 100 μL de PBS. Après le deuxième lavage, laissez 25 μL de PBS dans le puits.
   REMARQUE: Laisser PBS dans le puits réduit la probabilité de décollement de la cellule lors de l’ajout de liquide à l’étape suivante. Tous les lavages sont terminés avec le PBS laissé dedans; par conséquent, la solution ajoutée à l’étape suivante doit toujours être préparée à une concentration de 2x car elle sera ajoutée dans un volume égal au PBS restant.
2. Fixer les cellules en ajoutant 25 μL d’une solution de formaldéhyde à 8 % dans du PBS avec 0,4 % de Triton X-100 et de Hoechst 33342 à une concentration de 4 μg/mL (les concentrations finales des réactifs individuels sont de 4 %, 0,2 % et 2 μg/mL, respectivement) (voir le tableau des matériaux).
3. Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.

7. Blocage

1. Rincer chaque puits quatre fois avec 100 μL de PBS. Après le dernier lavage, laissez 25 μL de PBS dans le puits.
2. Ajouter 25 μL de BSA à 6 % dans du PBS (la concentration finale de BSA est de 3 %) à chaque puits.
3. Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.

8. Ajout des anticorps primaires

1. Aspirer le BSA à l’aide d’une laveuse à microplaques et laisser 10 μL de solution dans le puits.
2. Ajouter 10 μL de la solution d’anticorps primaires préparée dans du BSA à 3% dans du PBS. Utiliser de l’anti-BrdU à 0,8 μg/mL et de l’anti-ADN à 0,4 μg/mL (les concentrations finales d’anticorps sont de 0,4 μg/mL et 0,2 μg/mL, respectivement) (voir le tableau des matériaux).
3. Incuber la plaque dans l’obscurité à 4 °C pendant la nuit.

9. Ajout des anticorps secondaires

1. Rincer chaque puits quatre fois avec 100 μL de PBS. Après le dernier lavage, laissez 10 μL de PBS dans le puits.
2. Ajouter 10 μL de la solution d’anticorps secondaires à 4 μg/mL préparée dans du BSA à 6 % dans du PBS (la concentration finale est de 2 μg/mL). Utiliser des anticorps spécifiques aux isotypes (IgG1 anti-souris et IgM anti-souris) conjugués à des fluorochromes tels que Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 555 (voir le tableau des matériaux).
3. Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 h.
4. Rincer chaque puits quatre fois avec 100 μL de PBS. Après le dernier lavage, laissez 50 μL de PBS dans le puits.
5. Scellez la plaque avec un film adhésif (voir Tableau des matériaux) et conservez-la à l’abri de l’obscurité à 4 °C. L’imagerie doit être effectuée dans les 2 semaines.

10. Imagerie

REMARQUE : L’imagerie doit être réalisée à l’aide d’un microscope à grand champ automatisé; Le microscope doit être équipé d’un étage moteur alimenté par des commandes permettant d’imager automatiquement les zones individuelles de la plaque.

1. Vérifiez les réglages de l’autofocus dans les coins de la plaque (puits A1, A24, P24, P1) et au centre.
   NOTE: Pour l’imagerie, il est recommandé d’utiliser un objectif de courte distance de travail 20x (voir Tableau des matériaux) avec l’ouverture numérique la plus élevée possible.
2. Sur la base des histogrammes d’intensité générés par le logiciel d’imagerie en mode Live View, sélectionnez un temps d’exposition suffisamment long pour les canaux de fluorescence individuels afin que l’image résultante ne soit pas sursaturée.
3. Définissez le nombre approprié de plans pour l’imagerie sur l’axe z.
   REMARQUE: Le champ de vision à un grossissement de 20x est suffisamment grand pour que toutes les cellules ne soient pas dans le même plan de focus, de sorte que la section z doit être effectuée pour afficher toutes les cellules dans leur plan de mise au point correct. Habituellement, cinq avions suffisent. En fonction de la disponibilité de l’espace disque, des piles z individuelles ou uniquement des projections d’intensité maximale peuvent être enregistrées. L’analyse d’image présentée dans la section des résultats représentatifs est basée sur des projections d’intensité maximale.
4. Sélectionnez le nombre approprié de champs de vision à afficher par puits.
   REMARQUE: Selon la confluence, environ 60-300 cellules peuvent être imagées dans un champ de vision. Typiquement, pour les cellules HeLa avec une confluence de 60% à 90%, l’imagerie à cinq champs de vision permettra d’analyser de 500 cellules à plus de 1 000 cellules.
5. Sélectionnez les puits à imager et lancez l’imagerie.

11. Analyse quantitative d’images

REMARQUE: L’analyse quantitative des images acquises peut être effectuée à l’aide d’un logiciel open source tel que Cell Profiler¹⁵. Pour la présente étude, l’analyse a été effectuée à l’aide du logiciel ScanR 3.0.0 (voir le tableau des matériaux).

1. Démarrez l’analyse en effectuant une correction d’arrière-plan pour toutes les images de tous les canaux de fluorescence. En fonction de la taille des objets analysés, sélectionnez la taille de filtre appropriée : 80 pixels pour les noyaux cellulaires et 4 pixels pour les taches BrdU et ADNmt.
2. Commencez à segmenter l’image en créant un masque de l’objet principal basé sur le rapport de l’intensité du signal de fluorescence à l’arrière-plan du canal correspondant aux noyaux cellulaires.
3. Créez des masques pour les sous-objets représentant respectivement les taches BrdU et ADNmt, en utilisant les canaux de fluorescence appropriés pour les structures données.
   Remarque : Chaque sous-objet est affecté à l’objet principal le plus proche (noyau de cellule).
4. Définissez les paramètres à mesurer pendant l’analyse et mesurez l’intensité des pixels individuels dans chaque masque pour tous les canaux de fluorescence.
   NOTE: Il est également nécessaire de calculer le nombre de sous-objets affectés à un noyau cellulaire donné et l’aire de chaque sous-objet.
5. Définissez les paramètres dérivés à calculer en fonction des données obtenues. Pour obtenir les intensités de fluorescence totales pour le canal BrdU ou ADNmt, additionnez les intensités de tous les sous-objets assignés à un noyau cellulaire donné. Pour obtenir l’intensité moyenne de fluorescence, divisez l’intensité totale de fluorescence par la somme de l’aire des sous-objets affectés à un noyau cellulaire donné.
   REMARQUE: Pour s’assurer que le sous-objet créé (BrdU ou tache d’ADNmt) est réellement situé dans les mitochondries, il est nécessaire de les ouvrir en fonction de l’intensité de fluorescence du colorant de suivi des mitochondries.
6. Effectuez une analyse plus approfondie des données obtenues avec le logiciel ScanR à l’aide du logiciel statistique R 4.2.2¹⁶ avec les packages suivants : dplyr 17, data.table 18, ggplot2¹⁹ et ggpubr²⁰. Cette étape est facultative.

Résultats

Un schéma de la procédure pour l’étude à haut débit de la dynamique de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt est présenté à la figure 1. L’utilisation d’un format de plaque multipuits permet l’analyse simultanée de nombreuses conditions expérimentales différentes, telles que le silençage de différents gènes à l’aide d’une bibliothèque de siRNA. Les conditions utilisées pour le marquage des molécules d’ADN nouvellement synthétisées avec BrdU permett...

Discussion

Historiquement, le marquage de l’ADN par incorporation BrdU et la détection d’anticorps a été utilisé dans la réplication de l’ADN nucléaire et la recherche sur le cycle cellulaire 14,27,28. Jusqu’à présent, tous les protocoles de détection de l’ADN marqué BrdU ont inclus une étape de dénaturation de l’ADN (acide ou thermique) ou de digestion enzymatique (DNase ou protéinase) pour permettre l’expositio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus