Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

Résumé

Une procédure d’étude de la dynamique du métabolisme de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules à l’aide d’un format de plaque multipuits et d’une imagerie automatisée par immunofluorescence pour détecter et quantifier la synthèse et la distribution de l’ADNmt est décrite. Cela peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt.

Résumé

La grande majorité des processus cellulaires nécessitent un apport continu d’énergie, dont le porteur le plus courant est la molécule d’ATP. Les cellules eucaryotes produisent la majeure partie de leur ATP dans les mitochondries par phosphorylation oxydative. Les mitochondries sont des organites uniques parce qu’elles ont leur propre génome qui est répliqué et transmis à la génération suivante de cellules. Contrairement au génome nucléaire, il existe plusieurs copies du génome mitochondrial dans la cellule. L’étude détaillée des mécanismes responsables de la réplication, de la réparation et du maintien du génome mitochondrial est essentielle pour comprendre le bon fonctionnement des mitochondries et des cellules entières dans des conditions normales et pathologiques. Ici, une méthode qui permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules humaines cultivées in vitro est présentée. Cette approche est basée sur la détection par immunofluorescence de molécules d’ADN synthétisées activement marquées par incorporation de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) et la détection simultanée de toutes les molécules d’ADNmt avec des anticorps anti-ADN. De plus, les mitochondries sont visualisées avec des colorants ou des anticorps spécifiques. La culture de cellules dans un format multipuits et l’utilisation d’un microscope à fluorescence automatisé facilitent l’étude de la dynamique de l’ADNmt et de la morphologie des mitochondries dans diverses conditions expérimentales dans un temps relativement court.

Introduction

Pour la plupart des cellules eucaryotes, les mitochondries sont des organites essentiels, car elles jouent un rôle crucial dans de nombreux processus cellulaires. Tout d’abord, les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’énergie des cellules¹. Les mitochondries sont également impliquées dans la régulation de l’homéostasie cellulaire (par exemple, l’oxydox^{intracellulaire 2} et l’équilibre calcique³), la signalisation cellulaire^4,5, l’apoptose ⁶, la synthèse de différents composés biochimiques

Protocole

1. Préparation du mélange siRNA

1. Un jour avant le début de l’expérience, les cellules de graines (par exemple, HeLa) sur une boîte de 100 mm afin qu’elles atteignent 70% à 90% de confluence le lendemain.
   NOTE: Toutes les opérations doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire.
2. Préparer la quantité appropriée de siRNA diluée à une concentration de 140 nM dans un milieu Opti-MEM (voir tableau des matériaux). Une plaque de 96 puits peut être utilisée comme réservoir.
3. Ajouter 5 μL de la solution siRNA (ou du milieu Opti-MEM pour les échantillons témoins) à chaque pu....

Discussion

Historiquement, le marquage de l’ADN par incorporation BrdU et la détection d’anticorps a été utilisé dans la réplication de l’ADN nucléaire et la recherche sur le cycle cellulaire 14,27,28. Jusqu’à présent, tous les protocoles de détection de l’ADN marqué BrdU ont inclus une étape de dénaturation de l’ADN (acide ou thermique) ou de digestion enzymatique (DNase ou protéinase) pour permettre l’expositio.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus