Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений
В этой статье
Резюме
Описана процедура изучения динамики метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках с использованием формата многолуночного планшета и автоматизированной иммунофлуоресцентной визуализации для обнаружения и количественной оценки синтеза и распределения мтДНК. Это может быть дополнительно использовано для исследования влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК.
Аннотация
Подавляющее большинство клеточных процессов требует непрерывного снабжения энергией, наиболее распространенным переносчиком которой является молекула АТФ. Эукариотические клетки производят большую часть своего АТФ в митохондриях путем окислительного фосфорилирования. Митохондрии являются уникальными органеллами, потому что у них есть собственный геном, который реплицируется и передается следующему поколению клеток. В отличие от ядерного генома, в клетке есть несколько копий митохондриального генома. Детальное изучение механизмов, ответственных за репликацию, восстановление и поддержание митохондриального генома, имеет важное значение для понимания правильного функционирования митохондрий и целых клеток как в нормальных, так и в болезненных условиях. Здесь представлен метод, позволяющий с высокой пропускной способностью количественно определять синтез и распределение митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках человека, культивируемых in vitro . Этот подход основан на иммунофлуоресцентном обнаружении активно синтезируемых молекул ДНК, меченных включением 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), и одновременном обнаружении всех молекул мтДНК с анти-ДНК-антителами. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специфических красителей или антител. Культивирование клеток в многолуночном формате и использование автоматизированного флуоресцентного микроскопа облегчают изучение динамики мтДНК и морфологии митохондрий в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время.
Введение
Для большинства эукариотических клеток митохондрии являются важными органеллами, поскольку они играют решающую роль во многих клеточных процессах. Прежде всего, митохондрии являются ключевыми поставщиками энергии для клеток1. Митохондрии также участвуют в регуляции клеточного гомеостаза (например, внутриклеточный окислительно-восстановительныйпотенциал 2 и кальциевый баланс3), клеточной сигнализации 4,5, апоптозе6, синтезе различных биохимических соединений 7,8 и врожд....
протокол
1. Приготовление смеси миРНК
- За день до начала эксперимента семенные клетки (например, HeLa) помещают в чашку диаметром 100 мм так, чтобы на следующий день они достигли слияния 70%-90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны проводиться в стерильных условиях в ламинарной проточной камере. - Приготовьте соответствующее количество миРНК, разбавленной до концентрации 140 нМ в среде Opti-MEM (см. Таблицу материалов). В качестве резервуара можно использовать 96-луночную плиту.
- Добавьте 5 мкл раствора миРНК (или среды Opti-MEM для контрольных образцов) в каждую лунку черной 384-луночной микропланшетки для клеточной к....
Результаты
Схема процедуры высокопроизводительного исследования динамики синтеза и распределения мтДНК представлена на рисунке 1. Использование многолуночного формата планшета позволяет одновременно анализировать множество различных экспериментальных условий, таких как сай?.......
Обсуждение
Исторически сложилось так, что маркировка ДНК путем включения BrdU и обнаружения антител использовалась в репликации ядерной ДНК и исследованиях клеточного цикла 14,27,28. До сих пор все протоколы для обнаружения ДНК, меченной BrdU, включали ?.......
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным научным центром, Польша (номер гранта/премии: 2018/31/D/NZ2/03901).
....Материалы
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
Ссылки
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation....
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены