ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

要約

mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。

要約

細胞プロセスの大部分はエネルギーの継続的な供給を必要とし、その最も一般的なキャリアはATP分子です。真核細胞は、酸化的リン酸化によってミトコンドリアでATPの大部分を産生します。ミトコンドリアは、複製されて次世代の細胞に受け継がれる独自のゲノムを持っているため、ユニークな細胞小器官です。核ゲノムとは対照的に、細胞内にはミトコンドリアゲノムの複数のコピーがあります。ミトコンドリアゲノムの複製、修復、および維持に関与するメカニズムの詳細な研究は、正常状態と疾患状態の両方でミトコンドリアおよび細胞全体の適切な機能を理解するために不可欠です。ここでは、 インビトロで 培養したヒト細胞におけるミトコンドリアDNA(mtDNA)の合成および分布のハイスループット定量を可能にする方法が提示される。このアプローチは、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)取り込みによって標識された活発に合成されたDNA分子の免疫蛍光検出と、抗DNA抗体によるすべてのmtDNA分子の同時検出に基づいています。さらに、ミトコンドリアは特定の色素または抗体で可視化されます。マルチウェル形式で細胞を培養し、自動蛍光顕微鏡を利用することで、mtDNAの動態やミトコンドリアの形態を様々な実験条件下で比較的短時間で研究することが容易になります。

概要

ほとんどの真核細胞にとって、ミトコンドリアは多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすため、不可欠な細胞小器官です。何よりもまず、ミトコンドリアは細胞の主要なエネルギー供給者です¹。ミトコンドリアは、細胞の恒常性(例えば、細胞内酸化還元²およびカルシウムバランス³)、細胞シグナル伝達^4,5、アポトーシス⁶、異なる生化学的化合物の合成^7,8、および自然免疫応答⁹の調節にも関与しています。ミトコンドリア機能障害は、様々な病的状態およびヒト疾患に関連している¹⁰。

ミトコンドリアの機能は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの2つの別々のゲノムにある遺伝情報に依存します。ミトコンドリアゲノムは核ゲノムに比べて少数の遺伝子をコードしていますが、mtDNAにコードされた遺伝子はすべて人間の生活に不可欠です。mtDNAを維持するために必要なミトコンドリアタンパク質機構は、nDN....

プロトコル

1. siRNA混合物の調製

1. 実験開始の1日前に、細胞(例えば、HeLa)を100mmディッシュ上に播種し、翌日に70%〜90%のコンフルエントに達するようにする。
   注意: すべての操作は、層流チャンバー内の無菌条件下で実行する必要があります。
2. Opti-MEM培地で140 nMの濃度に希釈したsiRNAを適量調製します( 材料表参照)。96ウェルプレートをリザーバーとして使用できます。
3. 5 μLのsiRNA溶液(またはコントロールサンプルの場合はOpti-MEM培地)を黒色の384ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルに追加します。
   注:テストするsiRNAサンプルの数に応じて、電子ピペットまたはマルチチャンネルピペットを使用できます。
4. 適量のRNAiMAXトランスフェクション試薬溶液( 材料表参照)をOpti-MEM培地で調製します。培地100 μLごとにRNAiMAXを1 μL添加します。
5. 10 μLのトランスフェクション試薬溶液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これを行う最も便利で最速の方法は、試薬ディスペンサーを使用することです。
6. siRNAをトランスフェクション試薬とともに室温で30分間インキュベートします。

ディスカッション

歴史的に、BrdUの取り込みおよび抗体検出によるDNA標識は、核DNA複製および細胞周期研究において使用されてきた14,27,28。これまでのところ、BrdU標識DNAを検出するためのすべてのプロトコルには、エピトープの露出を可能にし、抗体の浸透を促進するためのDNA変性ステップ(酸性または熱)または酵素消化(DNaseまたはプロテイ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus