Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Riepilogo

Viene descritta una procedura per studiare la dinamica del metabolismo del DNA mitocondriale (mtDNA) nelle cellule utilizzando un formato di piastra multi-pozzetto e l'imaging automatizzato di immunofluorescenza per rilevare e quantificare la sintesi e la distribuzione del mtDNA. Questo può essere ulteriormente utilizzato per studiare gli effetti di vari inibitori, stress cellulari e silenziamento genico sul metabolismo del mtDNA.

Abstract

La stragrande maggioranza dei processi cellulari richiede una fornitura continua di energia, il cui vettore più comune è la molecola di ATP. Le cellule eucariotiche producono la maggior parte del loro ATP nei mitocondri mediante fosforilazione ossidativa. I mitocondri sono organelli unici perché hanno il loro genoma che viene replicato e trasmesso alla prossima generazione di cellule. In contrasto con il genoma nucleare, ci sono più copie del genoma mitocondriale nella cellula. Lo studio dettagliato dei meccanismi responsabili della replicazione, riparazione e mantenimento del genoma mitocondriale è essenziale per comprendere il corretto funzionamento dei mitocondri e delle cellule intere sia in condizioni normali che di malattia. Qui viene presentato un metodo che consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale (mtDNA) in cellule umane coltivate in vitro . Questo approccio si basa sulla rilevazione in immunofluorescenza di molecole di DNA sintetizzate attivamente marcate mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) e sulla rilevazione simultanea di tutte le molecole di mtDNA con anticorpi anti-DNA. Inoltre, i mitocondri sono visualizzati con coloranti o anticorpi specifici. La coltura di cellule in un formato multi-pozzetto e l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza automatizzato rendono più facile studiare la dinamica del mtDNA e la morfologia dei mitocondri in una varietà di condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve.

Introduzione

Per la maggior parte delle cellule eucariotiche i mitocondri sono organelli essenziali, in quanto svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi cellulari. Innanzitutto, i mitocondri sono i principali fornitori di energia delle cellule¹. I mitocondri sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi cellulare (ad esempio, redox intracellulare² e l'equilibrio del calcio³), segnalazione cellulare^4,5, apoptosi⁶, sintesi di diversi composti biochimici ^7,8 e risposta i....

Protocollo

1. Preparazione della miscela di siRNA

1. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, le cellule seme (ad esempio, HeLa) su un piatto di 100 mm in modo che raggiungano il 70% -90% di confluenza il giorno successivo.
   NOTA: Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili in una camera a flusso laminare.
2. Preparare la quantità appropriata di siRNA diluito ad una concentrazione di 140 nM nel mezzo Opti-MEM (vedere Tabella dei materiali). Una piastra da 96 pozzetti può essere utilizzata come serbatoio.
3. Aggiungere 5 μL della soluzione di siRNA (o mezzo Opti-MEM per i campioni di controllo) a c....

Discussione

Storicamente, l'etichettatura del DNA mediante incorporazione BrdU e rilevamento di anticorpi è stata utilizzata nella replicazione del DNA nucleare e nella ricerca sul ciclo cellulare 14,27,28. Finora, tutti i protocolli per rilevare il DNA marcato con BrdU hanno incluso una fase di denaturazione del DNA (acida o termica) o digestione enzimatica (DNasi o proteinasi) per consentire l'esposizione all'epitopo e facilitare la pene.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus