Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Riepilogo

Viene descritta una procedura per studiare la dinamica del metabolismo del DNA mitocondriale (mtDNA) nelle cellule utilizzando un formato di piastra multi-pozzetto e l'imaging automatizzato di immunofluorescenza per rilevare e quantificare la sintesi e la distribuzione del mtDNA. Questo può essere ulteriormente utilizzato per studiare gli effetti di vari inibitori, stress cellulari e silenziamento genico sul metabolismo del mtDNA.

Abstract

La stragrande maggioranza dei processi cellulari richiede una fornitura continua di energia, il cui vettore più comune è la molecola di ATP. Le cellule eucariotiche producono la maggior parte del loro ATP nei mitocondri mediante fosforilazione ossidativa. I mitocondri sono organelli unici perché hanno il loro genoma che viene replicato e trasmesso alla prossima generazione di cellule. In contrasto con il genoma nucleare, ci sono più copie del genoma mitocondriale nella cellula. Lo studio dettagliato dei meccanismi responsabili della replicazione, riparazione e mantenimento del genoma mitocondriale è essenziale per comprendere il corretto funzionamento dei mitocondri e delle cellule intere sia in condizioni normali che di malattia. Qui viene presentato un metodo che consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale (mtDNA) in cellule umane coltivate in vitro . Questo approccio si basa sulla rilevazione in immunofluorescenza di molecole di DNA sintetizzate attivamente marcate mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) e sulla rilevazione simultanea di tutte le molecole di mtDNA con anticorpi anti-DNA. Inoltre, i mitocondri sono visualizzati con coloranti o anticorpi specifici. La coltura di cellule in un formato multi-pozzetto e l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza automatizzato rendono più facile studiare la dinamica del mtDNA e la morfologia dei mitocondri in una varietà di condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve.

Introduzione

Per la maggior parte delle cellule eucariotiche i mitocondri sono organelli essenziali, in quanto svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi cellulari. Innanzitutto, i mitocondri sono i principali fornitori di energia delle cellule¹. I mitocondri sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi cellulare (ad esempio, redox intracellulare² e l'equilibrio del calcio³), segnalazione cellulare^4,5, apoptosi⁶, sintesi di diversi composti biochimici ^7,8 e risposta immunitaria innata⁹. La disfunzione mitocondriale è associata a vari stati patologici e malattie umane¹⁰.

Il funzionamento dei mitocondri dipende dall'informazione genetica situata in due genomi separati: il genoma nucleare e mitocondriale. Il genoma mitocondriale codifica per un piccolo numero di geni rispetto al genoma nucleare, ma tutti i geni codificati dal mtDNA sono essenziali per la vita umana. Il meccanismo proteico mitocondriale necessario per mantenere il mtDNA è codificato dall'nDNA. I componenti di base del replisoma mitocondriale, così come alcuni fattori di biogenesi mitocondriale, sono già stati identificati (rivisti nella ricerca precedente^11,12). Tuttavia, i meccanismi di replicazione e mantenimento del DNA mitocondriale sono ancora lontani dall'essere compresi. A differenza dell'nDNA, il genoma mitocondriale esiste in più copie, il che fornisce un ulteriore strato per regolare l'espressione genica mitocondriale. Molto meno si sa attualmente sulla distribuzione e la segregazione del mtDNA all'interno degli organelli, in che misura questi processi sono regolati e, se lo sono, quali proteine sono coinvolte¹³. Il modello di segregazione è cruciale quando le cellule contengono una popolazione mista di mtDNA wild-type e mutato. La loro distribuzione ineguale può portare alla generazione di cellule con una quantità dannosa di mtDNA mutato.

Finora, i fattori proteici necessari per il mantenimento del mtDNA sono stati identificati principalmente con metodi biochimici, analisi bioinformatiche o attraverso studi associati alla malattia. In questo lavoro, al fine di garantire un'alta probabilità di identificare fattori che in precedenza sono sfuggiti all'identificazione, viene descritta una strategia diversa. Il metodo si basa sulla marcatura del mtDNA durante la replicazione o la riparazione con 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), un analogo nucleosidico della timidina. BrdU è facilmente incorporato nei filamenti di DNA nascente durante la sintesi del DNA e, in generale, viene utilizzato per monitorare la replicazione del DNA nucleare¹⁴. Tuttavia, la procedura sviluppata qui è stata ottimizzata per rilevare BrdU incorporato nel mtDNA utilizzando l'immunofluorescenza degli anticorpi anti-BrdU.

L'approccio consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA in cellule umane coltivate in vitro. È necessaria una strategia ad alto rendimento per condurre test in diverse condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve; Pertanto, si propone nel protocollo di utilizzare un formato multi-pozzo per la coltura cellulare e la microscopia a fluorescenza automatizzata per l'imaging. Il protocollo include la trasfezione di cellule HeLa umane con una libreria di siRNA e il successivo monitoraggio della replicazione o riparazione del mtDNA utilizzando la marcatura metabolica del DNA appena sintetizzato con BrdU. Questo approccio è combinato con l'immunocolorazione del DNA con l'aiuto di anticorpi anti-DNA. Entrambi i parametri vengono analizzati utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza. Inoltre, i mitocondri vengono visualizzati con un colorante specifico. Per dimostrare la specificità del protocollo, la colorazione BrdU è stata testata su cellule prive di mtDNA (cellule rho0), su cellule HeLa dopo il silenziamento di noti fattori di mantenimento del mtDNA e su cellule HeLa dopo trattamento con un inibitore della replicazione del mtDNA. I livelli di mtDNA sono stati misurati anche con un metodo indipendente, vale a dire qPCR.

Protocollo

1. Preparazione della miscela di siRNA

1. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, le cellule seme (ad esempio, HeLa) su un piatto di 100 mm in modo che raggiungano il 70% -90% di confluenza il giorno successivo.
   NOTA: Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili in una camera a flusso laminare.
2. Preparare la quantità appropriata di siRNA diluito ad una concentrazione di 140 nM nel mezzo Opti-MEM (vedere Tabella dei materiali). Una piastra da 96 pozzetti può essere utilizzata come serbatoio.
3. Aggiungere 5 μL della soluzione di siRNA (o mezzo Opti-MEM per i campioni di controllo) a ciascun pozzetto di una micropiastra di coltura cellulare nera a 384 pozzetti.
   NOTA: A seconda del numero di campioni di siRNA testati, è possibile utilizzare una pipetta elettronica o multicanale.
4. Preparare la quantità appropriata di soluzione di reagente di trasfezione RNAiMAX (vedere Tabella dei materiali) nel mezzo Opti-MEM. Aggiungere 1 μL di RNAiMAX per ogni 100 μL di terreno.
5. Aggiungere 10 μL della soluzione di reagente di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti. Il modo più conveniente e veloce per farlo è con un distributore di reagenti.
6. Incubare il siRNA con il reagente di trasfezione per 30 minuti a temperatura ambiente.

2. Preparazione delle cellule per la trasfezione

1. Durante l'incubazione (fase 1.6), aspirare il mezzo utilizzando un dispositivo di aspirazione (vedere Tabella dei materiali) e lavare le celle con 3 ml di PBS.
2. Aggiungere 1,5 mL di tripsina diluita 1:2 in PBS e incubare le cellule a 37 °C per 10 minuti.
3. Controlla se le celle si sono staccate; in tal caso, aggiungere 3 ml di terreno DMEM con FBS al 10%. Sospendere accuratamente le cellule e trasferirle in un tubo da 15 ml. Prelevare almeno 150 μL della sospensione e contare le celle in una camera per il conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali).
4. Preparare una sospensione cellulare alla concentrazione appropriata (35.000 / ml per la linea HeLa) in mezzo DMEM con 10% FBS, penicillina e streptomicina.

3. Trasfezione cellulare

1. Aggiungere 20 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti utilizzando il dosatore di reagenti. Ciò si tradurrà in 700 cellule seminate per pozzetto.
2. Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente, quindi metterle nell'incubatore per 72 ore (37 °C e 5% CO₂).

4. Costituzione di BrdU

1. Preparare una soluzione da 90 μM di BrdU (vedere Tabella dei materiali) in mezzo DMEM con FBS al 10%.
2. A 56 ore dopo la trasfezione di siRNA (16 ore prima della fissazione cellulare), aggiungere 10 μL di soluzione di BrdU a 90 μM a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti (la concentrazione finale di BrdU è di 20 μM).
   NOTA: l'azione deve essere eseguita il più velocemente possibile; Pertanto, è meglio utilizzare un distributore di reagenti, una pipetta elettronica o una pipetta multi-dispenser. Ricordarsi di preparare pozzetti di controllo senza l'aggiunta di BrdU.
3. Incubare le cellule per 16 ore (37 °C e 5% CO₂).

5. Etichettatura dei mitocondri

1. Preparare una soluzione da 20 μM di BrdU in DMEM con FBS al 10% e aggiungere ad essa la soluzione di colorante tracciante dei mitocondri (vedi Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 1,1 μM.
2. A 15 ore dall'inizio dell'incorporazione di BrdU (1 ora prima della fissazione cellulare), aggiungere 10 μL della soluzione di colorante che traccia i mitocondri (vedi Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti (la concentrazione finale del colorante è 200 nM).
   NOTA: utilizzare un distributore di reagenti, una pipetta elettronica o una pipetta multi-dispenser. Ricordarsi di conservare i pozzetti di controllo senza l'aggiunta di BrdU ma con l'aggiunta del colorante di tracciamento dei mitocondri.
3. Incubare le cellule per 1 ora (37 °C e 5% di CO₂).

6. Fissazione cellulare

NOTA: Tutto il lavaggio viene eseguito più comodamente utilizzando una lavatrice a micropiastre, mentre l'aggiunta di reagenti viene eseguita più rapidamente utilizzando un distributore di reagenti.

1. Utilizzando la rondella a micropiastre (vedere Tabella dei materiali), sciacquare ogni pozzetto due volte con 100 μL di PBS. Dopo il secondo lavaggio, lasciare 25 μL di PBS nel pozzetto.
   NOTA: Lasciare PBS nel pozzetto riduce la probabilità di distacco cellulare durante l'aggiunta di liquido nella fase successiva. Tutti i lavaggi sono completati con il PBS lasciato dentro; pertanto, la soluzione aggiunta nel passaggio successivo deve sempre essere preparata a una concentrazione 2x in quanto verrà aggiunta in un volume uguale al PBS rimanente.
2. Fissare le cellule aggiungendo 25 μL di una soluzione di formaldeide all'8% in PBS con Triton X-100 allo 0,4% e Hoechst 33342 ad una concentrazione di 4 μg/mL (le concentrazioni finali dei singoli reagenti sono rispettivamente 4%, 0,2% e 2 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
3. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.

7. Blocco

1. Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 25 μL di PBS nel pozzetto.
2. Aggiungere 25 μL di BSA al 6% in PBS (la concentrazione finale di BSA è del 3%) a ciascun pozzetto.
3. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.

8. Aggiunta degli anticorpi primari

1. Aspirare il BSA utilizzando una rondella a micropiastre e lasciare 10 μL di soluzione nel pozzetto.
2. Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale primaria preparata in BSA al 3% in PBS. Utilizzare anti-BrdU a 0,8 μg/mL e anti-DNA a 0,4 μg/mL (le concentrazioni finali di anticorpi sono rispettivamente 0,4 μg/mL e 0,2 μg/mL) (vedere Tabella dei materiali).
3. Incubare la piastra al buio a 4 °C durante la notte.

9. Aggiunta degli anticorpi secondari

1. Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 10 μL di PBS nel pozzetto.
2. Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale secondaria da 4 μg/mL preparata in BSA al 6% in PBS (la concentrazione finale è 2 μg/ml). Utilizzare anticorpi isotipo-specifici (IgG1 anti-topo e IgM anti-topo) coniugati a fluorocromi come Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555 (vedi Tabella dei materiali).
3. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 50 μL di PBS nel pozzetto.
5. Sigillare la piastra con una pellicola sigillante adesiva (vedi Tabella dei materiali) e conservarla al buio a 4 °C. L'imaging deve essere eseguito entro 2 settimane.

10. Imaging

NOTA: l'imaging deve essere eseguito con un microscopio a campo largo automatizzato; Il microscopio deve essere dotato di uno stadio motore fornito con comandi per visualizzare automaticamente le singole aree della lastra.

1. Controllare le impostazioni di messa a fuoco automatica nelle aree angolari della piastra (pozzetti A1, A24, P24, P1) e al centro.
   NOTA: per l'imaging, si consiglia di utilizzare un obiettivo a breve distanza di lavoro 20x (vedere Tabella dei materiali) con la massima apertura numerica possibile.
2. In base all'intensità degli istogrammi generati dal software di imaging in modalità live view, selezionare un tempo di esposizione sufficientemente lungo per i singoli canali di fluorescenza in modo che l'immagine risultante non sia sovrasatura.
3. Impostare il numero appropriato di piani per l'imaging sull'asse z.
   NOTA: il campo visivo con ingrandimento 20x è abbastanza grande da non consentire a tutte le celle di trovarsi sullo stesso piano di messa a fuoco, è necessario eseguire la sezione Z per visualizzare tutte le celle nel piano di messa a fuoco corretto. Di solito, cinque aerei sono sufficienti. A seconda della disponibilità di spazio su disco, è possibile salvare singoli z-stack o solo proiezioni di intensità massima. L'analisi delle immagini mostrata nella sezione dei risultati rappresentativi si basa su proiezioni di massima intensità.
4. Selezionare il numero appropriato di campi visivi da visualizzare per ogni riotto.
   NOTA: A seconda della confluenza, è possibile visualizzare circa 60-300 celle in un campo visivo. Tipicamente, per le cellule HeLa con una confluenza del 60% -90%, l'imaging di cinque campi visivi consentirà di analizzare da 500 cellule a oltre 1.000 cellule.
5. Seleziona i pozzi da fotografare e inizia l'imaging.

11. Analisi quantitativa delle immagini

NOTA: L'analisi quantitativa delle immagini acquisite può essere eseguita utilizzando un software open source come Cell Profiler¹⁵. Per il presente studio, l'analisi è stata eseguita utilizzando il software ScanR 3.0.0 (vedere la tabella dei materiali).

1. Avviare l'analisi eseguendo la correzione dello sfondo per tutte le immagini provenienti da tutti i canali di fluorescenza. A seconda delle dimensioni degli oggetti analizzati, selezionare la dimensione del filtro appropriata: 80 pixel per i nuclei cellulari e 4 pixel per le macchie di BrdU e mtDNA.
2. Inizia a segmentare l'immagine creando una maschera dell'oggetto principale in base al rapporto tra l'intensità del segnale di fluorescenza e lo sfondo per il canale corrispondente ai nuclei cellulari.
3. Creare maschere per i sotto-oggetti che rappresentano rispettivamente le macchie di BrdU e mtDNA, utilizzando i canali di fluorescenza appropriati per le strutture date.
   NOTA: Ogni oggetto secondario è assegnato all'oggetto principale più vicino (nucleo cellulare).
4. Impostare i parametri da misurare durante l'analisi e misurare l'intensità dei singoli pixel all'interno di ciascuna maschera per tutti i canali di fluorescenza.
   NOTA: È anche necessario calcolare il numero di sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare e l'area di ciascun sotto-oggetto.
5. Definire i parametri derivati da calcolare in base ai dati ottenuti. Per ottenere le intensità totali di fluorescenza per il canale BrdU o mtDNA, sommare le intensità di tutti i sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare. Per ottenere l'intensità media di fluorescenza, dividere l'intensità totale della fluorescenza per la somma dell'area dei sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare.
   NOTA: Per garantire che il sotto-oggetto creato (BrdU o macchia di mtDNA) si trovi effettivamente nei mitocondri, è necessario controllarli in base all'intensità della fluorescenza del colorante di tracciamento dei mitocondri.
6. Eseguire ulteriori analisi dei dati ottenuti con il software ScanR utilizzando il software statistico R 4.2.2¹⁶ insieme ai seguenti pacchetti: dplyr 17, data.table 18, ggplot2¹⁹ e ggpubr ²⁰. Questo passaggio è facoltativo.

Risultati

Uno schema della procedura per lo studio ad alto rendimento della dinamica della sintesi e della distribuzione del mtDNA è mostrato nella Figura 1. L'uso di un formato di piastra multi-pozzetto consente l'analisi simultanea di molte condizioni sperimentali diverse, come il silenziamento di diversi geni utilizzando una libreria di siRNA. Le condizioni utilizzate per la marcatura di molecole di DNA di nuova sintesi con BrdU consentono la rilevazione di DNA marcato con BrdU nei mitocondri dell...

Discussione

Storicamente, l'etichettatura del DNA mediante incorporazione BrdU e rilevamento di anticorpi è stata utilizzata nella replicazione del DNA nucleare e nella ricerca sul ciclo cellulare 14,27,28. Finora, tutti i protocolli per rilevare il DNA marcato con BrdU hanno incluso una fase di denaturazione del DNA (acida o termica) o digestione enzimatica (DNasi o proteinasi) per consentire l'esposizione all'epitopo e facilitare la pene...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus