Un procedimiento controlado por estimulación para la evaluación de las funciones diastólicas dependientes de la frecuencia cardíaca en modelos murinos de insuficiencia cardíaca

Resumen

El presente protocolo describe la obtención de la relación presión-volumen a través de la estimulación transesofágica, que sirve como una herramienta valiosa en la evaluación de la función diastólica en modelos murinos de insuficiencia cardíaca.

Resumen

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una afección caracterizada por disfunción diastólica e intolerancia al ejercicio. Si bien las pruebas hemodinámicas estresadas por el ejercicio o la resonancia magnética se pueden utilizar para detectar la disfunción diastólica y diagnosticar la ICFEP en humanos, estas modalidades son limitadas en la investigación básica que utiliza modelos de ratón. Una prueba de ejercicio en cinta rodante se usa comúnmente para este propósito en ratones, pero sus resultados pueden verse influenciados por el peso corporal, la fuerza del músculo esquelético y el estado mental. Aquí, describimos un protocolo de estimulación auricular para detectar cambios dependientes de la frecuencia cardíaca (FC) en el rendimiento diastólico y validar su utilidad en un modelo murino de ICFEP. El método consiste en anestesiar, intubar y realizar análisis de bucle presión-volumen (PV) concomitante con la estimulación auricular. En este trabajo, se insertó un catéter de conductancia a través de un abordaje apical del ventrículo izquierdo y se colocó un catéter de estimulación auricular en el esófago. Se recogieron los bucles de VP basales antes de ralentizar la FC con ivabradina. Los bucles de VP se recogieron y analizaron en incrementos de FC que oscilaron entre 400 lpm y 700 lpm a través de la estimulación auricular. Utilizando este protocolo, demostramos claramente la insuficiencia diastólica dependiente de la FC en un modelo de ICFEP inducida metabólicamente. Tanto la constante de tiempo de relajación (Tau) como la relación presión-volumen diastólico final (EDPVR) empeoraron a medida que aumentaba la FC en comparación con los ratones control. En conclusión, este protocolo controlado por estimulación auricular es útil para detectar disfunciones cardíacas dependientes de la FC. Proporciona una nueva forma de estudiar los mecanismos subyacentes de la disfunción diastólica en modelos de ratón con ICFEP y puede ayudar a desarrollar nuevos tratamientos para esta afección.

Introducción

La insuficiencia cardíaca representa una de las principales causas de hospitalización y muerte en todo el mundo, y la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) representa alrededor del 50% de todos los diagnósticos de insuficiencia cardíaca. La ICFEP se caracteriza por disfunción diastólica y alteración de la tolerancia al ejercicio, y las anomalías hemodinámicas asociadas, como la disfunción diastólica, pueden detectarse claramente a través de pruebas hemodinámicas sometidas a estrés por ejercicio o resonancias magnéticas ^1,2.

En los modelos experimentales, sin embargo, las modalidades disponibles para evaluar las anomalías fisiológicas relacionadas con la ICFEP son limitadas ^3,4. La prueba de esfuerzo en cinta rodante (TMT) se utiliza para determinar el tiempo y la distancia de carrera, lo que podría reflejar la hemodinámica cardíaca de estrés por ejercicio; Sin embargo, este método es susceptible a la interferencia de variables extrañas como el peso corporal, la fuerza del músculo esquelético y el estado mental.

Para sortear estas limitaciones, hemos ideado un protocolo de estimulación auricular que detecta cambios sutiles pero cruciales en el rendimiento diastólico en función de la frecuencia cardíaca (FC) y hemos validado su utilidad en un modelo murino de ICFEP⁵. Varios factores fisiológicos contribuyen a la función cardíaca relacionada con el ejercicio, incluyendo el nervio simpático y la respuesta catecolamina, la vasodilatación periférica, la respuesta endotelial y la frecuencia cardíaca⁶. Entre estos, sin embargo, la relación FC-presión (también llamada efecto Bowditch) es conocida como un determinante crítico de las características fisiológicas cardíacas ^7,8,9.

El protocolo consiste en realizar un análisis convencional de presión-volumen al inicio del estudio para evaluar la función sistólica y diastólica, incluyendo parámetros como la tasa de desarrollo de la presión (dp/dt), la relación presión-volumen telesistólico (ESPVR) y la relación presión-volumen telediastólica (EDPVR). Sin embargo, hay que tener en cuenta que estos parámetros están influenciados por la FC, que puede variar entre animales debido a las diferencias en su frecuencia cardíaca intrínseca. Además, también se deben considerar los efectos de la anestesia en la FC. Para abordar esto, la FC se estandarizó mediante la administración de estimulación auricular concomitantemente con ivabradina, y se realizaron mediciones de parámetros cardíacos a frecuencias cardíacas incrementales. En particular, la respuesta cardíaca dependiente de la FC distinguió a los ratones con ICFEP de los ratones del grupo control, mientras que no se observaron diferencias significativas en las mediciones basales del bucle de VP (utilizando la frecuencia cardíaca intrínseca)⁵.

Si bien este protocolo de estimulación puede parecer relativamente complicado, su tasa de éxito supera el 90% cuando se comprende bien. Este protocolo proporcionaría una forma útil de estudiar los mecanismos subyacentes de la disfunción diastólica en modelos de ratón con ICFEP y ayudaría en el desarrollo de nuevos tratamientos para esta afección.

Protocolo

Este protocolo con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y siguió las regulaciones para experimentos con animales y actividades relacionadas en la Universidad de Tokio. Para el presente estudio, se utilizaron ratones machos C57/Bl6J de 8-12 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (véase la Tabla de Materiales). Se estableció un modelo de ICFEP mediante la administración de una dieta alta en grasas durante 15 semanas en conjunto con NG-nitro-L-arginina metil éster, como se describió anteriormente¹⁰.

1. Preparación del catéter y calibración de presión/volumen

1. Coloque un catéter de conductancia en solución salina normal y conéctelo a un módulo que consta del PowerLab 8/35 y una unidad de presión-volumen (módulo MPVS, consulte la Tabla de materiales).
2. Calibrar electrónicamente la presión y el volumen mediante el registro de los parámetros predeterminados de presión (0 mmHg y 100 mmHg) y volumen (que varían entre los módulos MPVS) en el módulo MPVS ^3,11 (consulte también las instrucciones del fabricante).

2. Preparación de un animal para el cateterismo

1. Anestesia y ventilación
   1. Administrar una inyección intraperitoneal de 5 mg/kg de etomidato y 500 mg/kg de uretano (ver tabla de materiales) 5-10 min antes de la intubación.
      NOTA: El uretano, aunque es eficaz como agente anestésico en estudios con animales, se sospecha que es cancerígeno para los seres humanos. Por lo tanto, cuando el uretano es necesario para el logro de los objetivos experimentales y no basta con agentes alternativos, debe manipularse con precaución. Se exigen medidas de protección adecuadas, como el uso de guantes y mascarillas y el uso de una campana extractora durante la preparación. Como posible alternativa, se puede emplear ketamina (80 mg/kg, ip).
   2. Colocar al ratón en una cámara de anestesia previamente saturada con isoflurano al 2% y transferir al animal a una almohadilla térmica precalentada mantenida entre 38 °C y 40 °C durante la inducción de la anestesia.
   3. Afeita el área quirúrgica. Luego, desinfecte el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de betadine y alcohol.
   4. Haga una incisión horizontal (1-2 cm) en el cuello, extirpe el músculo traqueal y exponga la tráquea. Pase una sutura quirúrgica de seda 2-0 por debajo de la tráquea, elévela y haga una pequeña incisión (1-2 mm) para abrirla.
   5. Inserte un tubo endotraqueal en la tráquea y conéctelo a un ventilador que suministre una mezcla de 100 % de oxígeno y 2 % de isoflurano (reducida a 0,5 % a 1 % más adelante).
2. Inserción de catéter venoso central (CV) e inyección de líquido
   1. Localice la vena yugular interna debajo del músculo esternocleidomastoideo³.
   2. Inserte el catéter venoso central, que consiste en un tubo silástico de PE-10 (consulte la Tabla de materiales) conectado a una aguja de 30 G, en la vena yugular.
   3. Administrar una perfusión en bolo de 5-6 μL/g de peso corporal de albúmina/NaCl al 10% durante 3 min, seguida de una velocidad de perfusión constante de 5-10 μL/min.
      NOTA: Este paso es crucial para prevenir la hipotensión resultante de la vasodilatación periférica causada por la anestesia. La vena yugular interna se encuentra entre el músculo esternocleidomastoideo y la arteria carótida, y tiene un color más oscuro que la arteria.

3. Procedimiento quirúrgico para cateterismo ventricular izquierdo (abordaje a tórax abierto)

1. Afeitar el área quirúrgica del ratón anestesiado. Luego, desinfecte el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de betadine y alcohol.
2. Confirme la profundidad de la anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie. A continuación, haz una incisión horizontal (2-3 cm) por debajo de la apófisis xifoides, y separa la piel de la pared torácica con unas tijeras romas.
3. Cortar lateralmente a través de la pared torácica en ambos lados usando cauterio eléctrico (ver la Tabla de Materiales).
4. Exponga el corazón cortando a través del diafragma y retire el pericardio suavemente del corazón con fórceps.
5. Inserte una aguja de 27 G en el vértice del ventrículo izquierdo (VI) e inserte retrógradamente un catéter de conductancia en el VI a través del orificio de punción.
6. Ajuste la posición del catéter de modo que se obtenga un bucle de presión-volumen de forma cuadrada.
7. Verifique que el catéter no entre en contacto con el músculo papilar cuando se producen cambios en las condiciones de carga comprobando la forma del asa VP durante la oclusión de la vena cava inferior (VCI).
   NOTA: La exposición adecuada del corazón facilita el procedimiento y ayuda a obtener una visión clara.

4. Registro de los datos del bucle fotovoltaico y determinación de la relación presión-volumen telesistólico (ESPVR) y la relación presión-volumen telediastólica (EDPVR)

NOTA: La reducción de la precarga por oclusión de la VCI permite la determinación del ESPVR y el EDPVR.

1. Registre y analice el bucle de presión-volumen (PV) de referencia con el software LabChart (consulte la Tabla de Materiales), PowerLab y el módulo MPVS después de la estabilización de la señal (5-10 minutos después de la canulación).
2. Realice la oclusión de la VCI comprimiendo la VCI con fórceps y registre el asa VP durante al menos 20 ciclos cardíacos durante la oclusión de la VCI. Determine el ESPVR ajustando una línea de regresión lineal a través de los puntos telesistólicos del bucle PV y el EDPVR ajustando una línea curvilínea a través de los puntos telediastólicos del bucle PV utilizando el software LabChart.
   NOTA: Detenga el ventilador durante la oclusión de la VCI para evitar artefactos de movimiento pulmonar. Un agente paralizante como el pancuronio (0,5-1 mg/kg) puede ser útil cuando el movimiento pulmonar es excesivo y debe usarse solo después de que se confirme un plano anestésico estable.

5. Estimulación transesofágica

1. Inserte un catéter de electrodo tetrapolar de 2 Fr en el esófago, conecte el catéter a un estimulador de pulsos (consulte la Tabla de materiales) y determine el umbral de captura auricular (normalmente, la amplitud del estímulo es de 3 mA y el ancho de pulso es de 1 ms).
2. Disminuir la FC por debajo de 400 latidos/min con 20 mg/kg de ivabradina (ver la Tabla de Materiales) administrada por vía intraperitoneal.
3. Después de la estabilización, adquiera 20 ciclos cardíacos continuos de bucles VP a diferentes ritmos de 400 latidos/min a 700 latidos/min, con un incremento de 100 latidos/min; Adquiera los ciclos durante 5 minutos a cada ritmo de ritmo.

6. Calibración salina y calibración del flujo aórtico

1. Inactivar el ventilador y administrar 5-10 μL de suero fisiológico hipertónico por vía intravenosa a través del catéter CV.
2. Documente las fluctuaciones de presión y volumen durante la inyección de solución salina y calcule el valor de Vp utilizando PowerLab ^3,11.
3. Repita la calibración salina para mejorar la precisión y la reproducibilidad.
4. Gire el ratón sobre su lado izquierdo para no perturbar la señal de volumen.
5. Realice una toracotomía lateral entre Th3 y Th5 hacia la columna vertebral y diseccione suavemente una pequeña parte de la aorta descendente con fórceps.
6. Coloque una sonda de flujo vascular (consulte la Tabla de materiales) sobre la aorta para medir el gasto cardíaco.
   NOTA: El cálculo preciso del volumen absoluto requiere el uso de dos tipos de calibración: calibración salina y calibración del flujo aórtico. Es importante reconocer los riesgos potenciales asociados con una infusión de solución salina hipertónica en sujetos animales, ya que la carga excesiva de sal puede resultar en una disminución de la contractilidad.

7. Eutanasia

1. Después del estudio, se sacrificó a los ratones bajo una sobredosis de anestesia a través de la luxación cervical.
   NOTA: Para asegurar el cese completo de la función vital, se emplea un método secundario de eutanasia, como la exanguinación bajo anestesia con posterior extracción de tejido cardíaco.

Resultados

Los datos de referencia del bucle fotovoltaico se muestran en la Figura 1 y en la Tabla 1. Al inicio del estudio (en ausencia de estimulación), no hubo diferencias significativas en los parámetros diastólicos, como la constante de tiempo de relajación (Tau), la tasa mínima de cambio de presión (dP/dt min) y EDPVR entre los ratones control y los ratones con HFpEF. Sin embargo, los ratones HFpEF exhibieron una presión arterial y una elastancia arterial (Ea) más altas, ...

Discusión

Presentamos una metodología para evaluar la relación presión-volumen con la aplicación de estimulación transesofágica. La intolerancia al ejercicio es una de las características clave de la ICFEP, sin embargo, no existen técnicas disponibles para la evaluación de la función cardíaca en ratones durante el ejercicio. Nuestro protocolo de estimulación ofrece una herramienta valiosa para detectar la disfunción diastólica, que puede no ser evidente en condiciones de reposo.

Para logra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies