Murin Kalp Yetmezliği Modellerinde Kalp Hızına Bağlı Diyastolik Fonksiyonların Değerlendirilmesi için Pacing Kontrollü Bir Prosedür

Özet

Mevcut protokol, kalp yetmezliğinin fare modellerinde diyastolik fonksiyonun değerlendirilmesinde değerli bir araç olarak hizmet eden transözofageal pacing yoluyla basınç-hacim ilişkisinin elde edilmesini açıklamaktadır.

Özet

Korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliği, diyastolik disfonksiyon ve egzersiz intoleransı ile karakterize bir durumdur. Diyastolik disfonksiyonu tespit etmek ve insanlarda HFpEF'i teşhis etmek için egzersiz stresli hemodinamik testler veya MRI kullanılabilirken, bu tür modaliteler fare modelleri kullanılarak yapılan temel araştırmalarda sınırlıdır. Farelerde bu amaç için yaygın olarak bir koşu bandı egzersiz testi kullanılır, ancak sonuçları vücut ağırlığı, iskelet kası gücü ve zihinsel durumdan etkilenebilir. Burada, diyastolik performansta kalp atış hızına (HR) bağlı değişiklikleri tespit etmek ve bir fare HFpEF modelinde kullanışlılığını doğrulamak için bir atriyal pacing protokolünü açıklıyoruz. Yöntem, anestezinin uygulanmasını, entübe edilmesini ve atriyal pacing ile birlikte basınç-hacim (PV) döngü analizinin gerçekleştirilmesini içerir. Bu çalışmada sol ventrikül apikal yaklaşımla bir iletkenlik kateteri yerleştirildi ve özofagusa bir atriyal pacing kateteri yerleştirildi. Temel PV döngüleri, HR ivabradin ile yavaşlatılmadan önce toplandı. PV döngüleri, atriyal pacing yoluyla 400 bpm ila 700 bpm arasında değişen HR artışlarında toplandı ve analiz edildi. Bu protokolü kullanarak, metabolik olarak indüklenen bir HFpEF modelinde HR'ye bağlı diyastolik bozukluğu açıkça gösterdik. Hem gevşeme süresi sabiti (Tau) hem de diyastol sonu basınç-hacim ilişkisi (EDPVR), kontrol farelerine kıyasla HR arttıkça kötüleşti. Sonuç olarak, bu atriyal pacing kontrollü protokol, HR'ye bağlı kardiyak disfonksiyonların saptanmasında yararlıdır. HFpEF fare modellerinde diyastolik disfonksiyonun altında yatan mekanizmaları incelemek için yeni bir yol sağlar ve bu durum için yeni tedaviler geliştirmeye yardımcı olabilir.

Giriş

Kalp yetmezliği, dünya çapında hastaneye yatış ve ölümün önde gelen bir nedenidir ve korunmuş ejeksiyon fraksiyonlu (HFpEF) kalp yetmezliği, tüm kalp yetmezliği tanılarının yaklaşık %50'sini oluşturur. HFpEF, diyastolik disfonksiyon ve bozulmuş egzersiz toleransı ile karakterizedir ve diyastolik disfonksiyon gibi ilişkili hemodinamik anormallikler, egzersiz stresli hemodinamik testler veya MRI taramaları ile açıkça tespit edilebilir ^1,2.

Bununla birlikte, deneysel modellerde, HFpEF ile ilgili fizyolojik anormallikleri değerlendirmek için mevcut yöntemler sınırlıdır ^3,4. Koşu bandı egzersiz testi (TMT), egzersiz-stres kardiyak hemodinamiğini yansıtabilecek koşu süresini ve mesafesini belirlemek için kullanılır; Bununla birlikte, bu yöntem vücut ağırlığı, iskelet kası gücü ve zihinsel durum gibi dış değişkenlerin müdahalesine karşı hassastır.

Bu sınırlamaları aşmak için, kalp atış hızına (HR) dayalı olarak diyastolik performanstaki ince ama önemli değişiklikleri tespit eden bir atriyal pacing protokolü geliştirdik ve HFpEF^5'in bir fare modelinde kullanışlılığını doğruladık. Sempatik sinir ve katekolamin yanıtı, periferik vazodilatasyon, endotel yanıtı ve kalp hızı dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik faktörler egzersizle ilişkili kardiyak fonksiyona katkıda bulunur⁶. Bununla birlikte, bunlar arasında, HR-basınç ilişkisi (Bowditch etkisi olarak da adlandırılır), kardiyak fizyolojik özelliklerin^kritik bir belirleyicisi olarak bilinir ^7,8,9.

Protokol, basınç gelişim hızı (dp/dt), sistolik sonu basınç-hacim ilişkisi (ESPVR) ve diyastolik sonu basınç-hacim ilişkisi (EDPVR) gibi parametreler dahil olmak üzere sistolik ve diyastolik işlevi değerlendirmek için başlangıçta geleneksel bir basınç-hacim analizi gerçekleştirmeyi içerir. Bununla birlikte, bu parametrelerin, içsel kalp atış hızlarındaki farklılıklar nedeniyle hayvanlar arasında değişebilen HR'den etkilendiğine dikkat edilmelidir. Ek olarak, anestezinin HR üzerindeki etkileri de göz önünde bulundurulmalıdır. Bunu ele almak için, HR, ivabradine ile birlikte atriyal pacing uygulanarak standardize edildi ve kardiyak parametre ölçümleri artımlı kalp hızlarında yapıldı. Özellikle, HR'ye bağlı kardiyak yanıt, HFpEF farelerini kontrol grubu farelerinden ayırırken, başlangıç PV döngü ölçümlerinde (içsel kalp atış hızı kullanılarak) önemli bir fark ^{gözlenmemiştir5}.

Bu pacing protokolü nispeten karmaşık görünse de, iyi anlaşıldığında başarı oranı %90'ı aşıyor. Bu protokol, HFpEF fare modellerinde diyastolik disfonksiyonun altında yatan mekanizmaları incelemek ve bu durum için yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak için yararlı bir yol sağlayacaktır.

Protokol

Bu hayvan protokolü, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Tokyo Üniversitesi'ndeki hayvan deneyleri ve ilgili faaliyetler için yönetmeliklere uydu. Bu çalışmada 8-12 haftalık erkek C57/Bl6J fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir ( bkz. Daha önce tarif edildiği gibi NG-nitro-L-arginin metil ester ile birlikte 15 hafta boyunca yüksek yağlı bir diyet uygulanarak bir HFpEF modeli oluşturulmuştur¹⁰.

1. Kateter preparatları ve basınç/hacim kalibrasyonu

1. Normal salin içine bir iletkenlik kateteri yerleştirin ve PowerLab 8/35 ve bir basınç-hacim ünitesinden oluşan bir modüle takın (MPVS modülü, Malzeme Tablosuna bakın).
2. MPVS modülü^0'de önceden belirlenmiş basınç (100 mmHg ve ^3,11 mmHg) ve hacim parametrelerinin (bunlar MPVS modülleri arasında değişir) kaydedilmesi yoluyla basıncı ve hacmi elektronik olarak kalibre edin (ayrıca üreticinin talimatlarına bakın).

2. Bir hayvanı kateterizasyon için hazırlama

1. Anestezi ve ventilasyon
   1. Entübasyondan 5-10 dakika önce 5 mg / kg etomidat ve 500 mg / kg üretan intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Üretan, hayvan çalışmalarında anestezik bir ajan olarak etkili olsa da, insanlar için kanserojen olduğundan şüphelenilmektedir. Bu nedenle, deneysel hedeflere ulaşmak için üretan gerekli olduğunda ve hiçbir alternatif ajan yeterli olmadığında, dikkatli kullanılmalıdır. Hazırlık sırasında eldiven ve maske takmak ve çeker ocak kullanmak gibi uygun koruyucu önlemler zorunludur. Olası bir alternatif olarak ketamin (80 mg/kg, ip) kullanılabilir.
   2. Fareyi daha önce% 2 izofluran ile doyurulmuş bir anestezi odasına yerleştirin ve anestezi indüksiyonu üzerine hayvanı 38 ° C ile 40 ° C arasında tutulan önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığına aktarın.
   3. Ameliyat bölgesini tıraş edin. Ardından, cerrahi bölgeyi üç alternatif betadin ve alkol ile dezenfekte edin.
   4. Boyunda yatay bir kesi (1-2 cm) yapın, trakeal kası çıkarın ve trakeayı ortaya çıkarın. Soluk borusunun altından cerrahi 2-0 ipek dikiş geçirin, yükseltin ve açmak için küçük bir kesi (1-2 mm) yapın.
   5. Trakeaya bir endotrakeal tüp yerleştirin ve% 100 oksijen ve% 2 izofluran karışımı sağlayan bir ventilatöre bağlayın (daha sonra% 0.5 ila% 1'e düşürülür).
2. Santral venöz (CV) kateter takılması ve sıvı enjeksiyonu
   1. Sternokleidomastoid kasın altındaki iç juguler veni bulun³.
   2. 30 G'lik bir iğneye bağlı PE-10 silastik borudan ( Malzeme Tablosuna bakınız) oluşan merkezi venöz kateteri juguler ven'e yerleştirin.
   3. 3 dakika boyunca 5-6 μL / g vücut ağırlığının% 10 albümin / NaCl bolus infüzyonunu ve ardından 5-10 μL / dak'lık sabit bir infüzyon hızını uygulayın.
      NOT: Bu adım, anestezinin neden olduğu periferik vazodilatasyondan kaynaklanan hipotansiyonu önlemek için çok önemlidir. İç juguler ven, sternokleidomastoid kas ile karotis arter arasında bulunur ve arterden daha koyu renkli görünür.

3. Sol ventrikül kateterizasyonu için cerrahi prosedür (açık göğüs yaklaşımı)

1. Anestezi uygulanan farenin cerrahi bölgesini tıraş edin. Ardından, cerrahi bölgeyi üç alternatif betadin ve alkol ile dezenfekte edin.
2. Ayak parmağınızı sıkıştırarak anestezi derinliğini onaylayın. Daha sonra, ksifoid işleminin altında yatay bir kesi (2-3 cm) yapın ve künt makas kullanarak cildi göğüs duvarından ayırın.
3. Elektrikli koter kullanarak göğüs duvarını her iki taraftan yanal olarak kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
4. Diyaframı keserek kalbi açığa çıkarın ve forseps kullanarak perikardları kalpten nazikçe çıkarın.
5. Sol ventrikülün (LV) tepesine 27 G'lik bir iğne yerleştirin ve delinme deliğinden LV'ye geriye dönük olarak bir iletkenlik kateteri yerleştirin.
6. Kateter pozisyonunu, kare şeklinde bir basınç-hacim döngüsü elde edilecek şekilde ayarlayın.
7. İnferior vena kava (IVC) oklüzyonu sırasında PV döngüsünün şeklini kontrol ederek yükleme koşullarında değişiklikler meydana geldiğinde kateterin papiller kasa temas etmediğini doğrulayın.
   NOT: Yeterli kalp maruziyeti prosedürü kolaylaştırır ve net bir görüş elde edilmesine yardımcı olur.

4. PV döngü verilerinin kaydedilmesi ve sistolik sonu basınç-hacim ilişkisinin (ESPVR) ve diyastol sonu basınç-hacim ilişkisinin (EDPVR) belirlenmesi

NOT: IVC oklüzyonu ile ön yükün azaltılması, ESPVR ve EDPVR'nin belirlenmesini sağlar.

1. Sinyal stabilizasyonundan sonra (kanülasyondan 5-10 dakika sonra) LabChart yazılımı (Malzeme Tablosuna bakın), PowerLab ve MPVS modülü ile temel basınç-hacim (PV) döngüsünü kaydedin ve analiz edin.
2. IVC'yi forseps ile sıkıştırarak IVC oklüzyonu gerçekleştirin ve IVC oklüzyonu sırasında PV döngüsünü en az 20 kardiyak döngü için kaydedin. LabChart yazılımını kullanarak PV döngüsünün sistolik uç noktalarından doğrusal bir regresyon çizgisi geçirerek ESPVR'yi ve PV döngüsünün diyastol sonu noktalarından eğrisel bir çizgi geçirerek EDPVR'yi belirleyin.
   NOT: Akciğer hareket artefaktlarını önlemek için IVC tıkanıklığı sırasında ventilatörü durdurun. Pankuronyum (0.5-1 mg / kg) gibi paralitik bir ajan, akciğer hareketi aşırı olduğunda yardımcı olabilir ve sadece stabil bir anestezik düzlem onaylandıktan sonra kullanılmalıdır.

5. Transözofageal pacing

1. Yemek borusuna 2-Fr tetrapolar elektrot kateteri yerleştirin, kateteri bir nabız stimülatörüne bağlayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve atriyal yakalama eşiğini belirleyin (normalde uyaran genliği 3 mA'dır ve nabız genişliği 1 ms'dir).
2. İntraperitoneal olarak uygulanan 20 mg / kg ivabradin (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak HR'yi 400 atım / dk'nın altına yavaşlatın.
3. Stabilizasyonu takiben, 100 atım/dk'lık bir artışla 400 atım/dk'dan 700 atım/dk'ya kadar farklı hızlarda 20 sürekli kardiyak PV döngüsü döngüsü elde edin; Her ilerleme hızında 5 dakikadan fazla döngüleri elde edin.

6. Salin kalibrasyonu ve aort akış kalibrasyonu

1. Ventilatörü etkisiz hale getirin ve CV kateterinden intravenöz olarak 5-10 μL hipertonik salin solüsyonu uygulayın.
2. Salin enjeksiyonu sırasında basınç ve hacimdeki dalgalanmaları belgeleyin ve PowerLab ^3,11 kullanarak Vp değerini hesaplayın.
3. Doğruluğu ve tekrarlanabilirliği artırmak için salin kalibrasyonunu tekrarlayın.
4. Ses sinyalini bozmamak için fareyi sol tarafına çevirin.
5. Omurgaya doğru Th3 ila Th5 arasında lateral torakotomi yapın ve inen aortun küçük bir kısmını forseps ile nazikçe inceleyin.
6. Kardiyak debiyi ölçmek için aortun üzerine bir vasküler akış probu ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
   NOT: Mutlak hacmin doğru hesaplanması için iki tür kalibrasyonun kullanılması gerekir: tuzlu su kalibrasyonu ve aort akışı kalibrasyonu. Hayvan deneklerde hipertonik salin infüzyonu ile ilişkili potansiyel riskleri tanımak önemlidir, çünkü aşırı tuz yüklemesi kasılmada bir düşüşe neden olabilir.

7. Ötenazi

1. Çalışmadan sonra, fareleri servikal çıkık yoluyla anestezik doz aşımı altında ötenazi yapın.
   NOT: Hayati fonksiyonun tamamen durmasını sağlamak için, anestezi altında kan kaybı ve ardından kalp dokusu toplama gibi ikincil bir ötenazi yöntemi kullanılır.

Sonuçlar

Temel PV döngü verileri Şekil 1 ve Tablo 1'de gösterilmektedir. Başlangıçta (pacing yokluğunda), kontrol ve HFpEF fareleri arasında gevşeme süresi sabiti (Tau), minimum basınç değişim oranı (dP / dt min) ve EDPVR gibi diyastolik parametrelerde anlamlı bir fark yoktu. Bununla birlikte, HFpEF fareleri, Şekil 1'de gösterildiği gibi daha yüksek kan basıncı ve arteriyel elastikans (Ea) sergiledi ve ventriküler sistol sırasın...

Tartışmalar

Transözofageal pacing uygulaması ile basınç-hacim ilişkilerini değerlendirmek için bir metodoloji sunuyoruz. Egzersiz intoleransı, HFpEF'in temel özelliklerinden biridir, ancak egzersiz sırasında farelerde kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi için herhangi bir teknik mevcut değildir. Pacing protokolümüz, dinlenme koşullarında belirgin olmayabilecek diyastolik disfonksiyonu tespit etmek için değerli bir araç sunar.

Doğru ve tutarlı kalitede bir PV döngüsü elde etmek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies