Um procedimento de estimulação cardíaca controlada para avaliação das funções diastólicas dependentes da frequência cardíaca em modelos murinos de insuficiência cardíaca

Resumo

O presente protocolo descreve a obtenção da relação pressão-volume por meio da estimulação transesofágica, que serve como uma ferramenta valiosa na avaliação da função diastólica em modelos murinos de insuficiência cardíaca.

Resumo

A insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) é uma condição caracterizada por disfunção diastólica e intolerância ao exercício. Embora testes hemodinâmicos ou ressonância magnética possam ser usados para detectar disfunção diastólica e diagnosticar ICFEP em humanos, tais modalidades são limitadas na pesquisa básica usando modelos de camundongos. Um teste ergométrico em esteira é comumente usado para esse fim em camundongos, mas seus resultados podem ser influenciados pelo peso corporal, força muscular esquelética e estado mental. Aqui, descrevemos um protocolo de estimulação atrial para detectar alterações no desempenho diastólico dependentes da frequência cardíaca (FC) e validar sua utilidade em um modelo de ICFEP em camundongos. O método envolve anestesia, intubação e análise de alça pressão-volume (PV) concomitante à estimulação atrial. Neste trabalho, um cateter de condutância foi inserido por via apical do ventrículo esquerdo e um cateter de estimulação atrial foi colocado no esôfago. Alças PV basais foram coletadas antes que a FC fosse retardada com ivabradina. As alças PV foram coletadas e analisadas em incrementos de FC variando de 400 bpm a 700 bpm via estimulação atrial. Usando esse protocolo, demonstramos claramente o comprometimento diastólico dependente da FC em um modelo de ICFEP metabolicamente induzida. Tanto a constante de tempo de relaxamento (Tau) quanto a relação pressão-volume diastólico final (EDPVR) pioraram à medida que a FC aumentou em comparação com camundongos controle. Em conclusão, este protocolo de estimulação atrial controlada é útil para detectar disfunções cardíacas dependentes de FC. Ele fornece uma nova maneira de estudar os mecanismos subjacentes da disfunção diastólica em modelos de camundongos com ICFEP e pode ajudar a desenvolver novos tratamentos para essa condição.

Introdução

A insuficiência cardíaca representa uma das principais causas de hospitalização e morte em todo o mundo, e a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) é responsável por cerca de 50% de todos os diagnósticos de insuficiência cardíaca. A ICFEP é caracterizada por disfunção diastólica e intolerância ao exercício, e as anormalidades hemodinâmicas associadas, como disfunção diastólica, podem ser claramente detectadas por meio de testes hemodinâmicos com estresse físico ou ressonância magnética ^1,2.

Em modelos experimentais, entretanto, as modalidades disponíveis para avaliar as anormalidades fisiológicas relacionadas à ICFEP são limitadas ^3,4. O teste ergométrico em esteira (TMT) é utilizado para determinar o tempo e a distância de corrida, o que pode refletir a hemodinâmica cardíaca do esforço-esforço; no entanto, esse método é suscetível à interferência de variáveis estranhas, como peso corporal, força muscular esquelética e estado mental.

Para contornar essas limitações, desenvolvemos um protocolo de estimulação atrial que detecta mudanças sutis, mas cruciais, no desempenho diastólico com base na frequência cardíaca (FC) e validamos sua utilidade em um modelo de ICFEP^em camundongos5. Vários fatores fisiológicos contribuem para a função cardíaca relacionada ao exercício, incluindo a resposta nervosa simpática e catecolamina, a vasodilatação periférica, a resposta endotelial e a frequência cardíaca⁶. Dentre estes, entretanto, a relação FC-pressão (também chamada de efeito Bowditch) é conhecida como determinante crítico^{das características} fisiológicas cardíacas7,8,9.

O protocolo envolve a realização de uma análise convencional pressão-volume no início do estudo para avaliar a função sistólica e diastólica, incluindo parâmetros como a taxa de desenvolvimento pressórico (dp/dt), a relação pressão-volume sistólico final (ESPVR) e a relação pressão-volume diastólica final (EDPVR). No entanto, deve-se ressaltar que esses parâmetros são influenciados pela FC, que pode variar entre os animais devido a diferenças em sua frequência cardíaca intrínseca. Além disso, os efeitos da anestesia sobre a FC também devem ser considerados. Para resolver isso, a FC foi padronizada pela aplicação de estimulação atrial concomitante à ivabradina, e as medidas dos parâmetros cardíacos foram realizadas em frequências cardíacas incrementais. Notavelmente, a resposta cardíaca HR-dependente distinguiu os camundongos ICFEP dos camundongos do grupo controle, enquanto não foram observadas diferenças significativas nas medidas basais da alça PV (usando a frequência cardíaca intrínseca)⁵.

Embora esse protocolo de estimulação possa parecer relativamente complicado, sua taxa de sucesso excede 90% quando bem compreendido. Esse protocolo forneceria uma maneira útil de estudar os mecanismos subjacentes da disfunção diastólica em modelos de ICFEP em camundongos e ajudar no desenvolvimento de novos tratamentos para essa condição.

Protocolo

Este protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e seguiu as normas para experimentação animal e atividades relacionadas da Universidade de Tóquio. Para o presente estudo, foram utilizados camundongos machos C57/Bl6J com 8-12 semanas de idade. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Um modelo de ICFEP foi estabelecido administrando-se uma dieta hiperlipídica por 15 semanas em conjunto com o éster metílico de NG-nitro-L-arginina, conforme descrito anteriormente¹⁰.

1. Preparo do cateter e calibração da pressão/volume

1. Coloque um cateter de condutância em soro fisiológico normal e conecte-o a um módulo composto pelo PowerLab 8/35 e uma unidade de pressão-volume (módulo MPVS, consulte a Tabela de Materiais).
2. Calibrar eletronicamente a pressão e o volume através do registro de parâmetros pré-determinados de pressão (0 mmHg e 100 mmHg) e volume (estes variam entre os módulos MPVS) no módulo MPVS ^3,11 (ver também as instruções do fabricante).

2. Preparar um animal para o cateterismo

1. Anestesia e ventilação
   1. Administrar uma injeção intraperitoneal de 5 mg/kg de etomidato e 500 mg/kg de uretano (ver Tabela de Materiais) 5-10 minutos antes da intubação.
      NOTA: Suspeita-se que o uretano, embora eficaz como agente anestésico em estudos com animais, seja cancerígeno para os seres humanos. Portanto, quando o uretano é necessário para o alcance dos objetivos experimentais e nenhum agente alternativo é suficiente, ele deve ser manuseado com cautela. Medidas de proteção adequadas, como o uso de luvas e máscaras e o uso de um exaustor durante o preparo, são obrigatórias. Como possível alternativa, a cetamina (80 mg/kg, ip) pode ser empregada.
   2. Colocar o camundongo em uma câmara de anestesia previamente saturada com isoflurano a 2% e transferir o animal para uma bolsa térmica pré-aquecida mantida entre 38 °C e 40 °C após a indução anestésica.
   3. Faça a raspagem da área cirúrgica. Em seguida, desinfete o local cirúrgico com três rodadas alternadas de betadina e álcool.
   4. Faça uma incisão horizontal (1-2 cm) no pescoço, extire o músculo traqueal e exponha a traqueia. Passar uma sutura cirúrgica de seda 2-0 sob a traqueia, elevá-la e fazer uma pequena incisão (1-2 mm) para abri-la.
   5. Insira um tubo endotraqueal na traqueia e conecte-o a um ventilador que forneça uma mistura de oxigênio a 100% e isoflurano a 2% (reduzido para 0,5% a 1% mais tarde).
2. Inserção de cateter venoso central (CV) e injeção de fluidos
   1. Localizar a veia jugular interna abaixo do músculo esternocleidomastoideo³.
   2. Insira o cateter venoso central, composto por tubo de silicone PE-10 (ver Tabela de Materiais) acoplado a uma agulha de 30 G, na veia jugular.
   3. Administrar uma infusão em bolus de 5-6 μL/g de peso corporal de albumina a 10%/NaCl durante 3 minutos, seguida de uma taxa de perfusão constante de 5-10 μL/min.
      OBS: Esta etapa é fundamental para prevenir a hipotensão arterial decorrente da vasodilatação periférica causada pela anestesia. A veia jugular interna está localizada entre o músculo esternocleidomastoideo e a artéria carótida, e parece de cor mais escura que a artéria.

3. Procedimento cirúrgico para cateterização do ventrículo esquerdo (abordagem torácica aberta)

1. Raspar a área cirúrgica do camundongo anestesiado. Em seguida, desinfete o local cirúrgico com três rodadas alternadas de betadina e álcool.
2. Confirme a profundidade da anestesia realizando uma pinça do dedo do pé. Em seguida, fazer uma incisão horizontal (2-3 cm) abaixo do processo xifoide e separar a pele da parede torácica com tesoura romba.
3. Cortar lateralmente a parede torácica em ambos os lados usando cautério elétrico (ver Tabela de Materiais).
4. Exponha o coração cortando o diafragma e remova o pericárdio suavemente do coração usando pinças.
5. Insira uma agulha 27G no ápice do ventrículo esquerdo (VE) e insira retrogradamente um cateter de condutância no VE através do orifício de punção.
6. Ajuste a posição do cateter para que se obtenha uma alça pressão-volume em forma de quadrado.
7. Verificar se o cateter não entra em contato com o músculo papilar quando ocorrem mudanças nas condições de carga, verificando a forma da alça PV durante a oclusão da veia cava inferior (VCI).
   NOTA: A exposição adequada do coração facilita o procedimento e ajuda a obter uma visão clara.

4. Registro dos dados da alça PV e determinação da relação pressão-volume sistólico final (ESPVR) e da relação pressão-volume diastólica final (EDPVR)

NOTA: A redução da pré-carga por oclusão da VCI permite a determinação da ESPVR e EDPVR.

1. Registre e analise o loop pressão-volume (PV) basal com o software LabChart (consulte a Tabela de Materiais), o PowerLab e o módulo MPVS após a estabilização do sinal (5-10 min após a canulação).
2. Realizar a oclusão da VCI comprimindo a VCI com pinça e registrar a alça do PV por pelo menos 20 ciclos cardíacos durante a oclusão da VCI. Determine a ESPVR ajustando uma linha de regressão linear através dos pontos sistólicos finais da alça PV e a EDPVR ajustando uma linha curvilínea através dos pontos diastólicos finais da alça PV usando o software LabChart.
   NOTA: Pare o ventilador durante a oclusão da VCI para evitar artefatos de movimento pulmonar. Um agente paralítico como o pancurônio (0,5-1 mg/kg) pode ser útil quando o movimento pulmonar é excessivo e deve ser usado somente após a confirmação de um plano anestésico estável.

5. Estimulação transesofágica

1. Insira um cateter de eletrodo tetrapolar de 2 Fr no esôfago, conecte o cateter a um estimulador de pulso (consulte a Tabela de Materiais) e determine o limiar de captura atrial (normalmente, a amplitude do estímulo é de 3 mA e a largura de pulso é de 1 ms).
2. Diminuir a FC abaixo de 400 batimentos/min utilizando 20 mg/kg de ivabradina (ver Tabela de Materiais) administrada por via intraperitoneal.
3. Após a estabilização, adquirir 20 ciclos cardíacos contínuos de alças de PV em diferentes taxas de estimulação de 400 batimentos/min a 700 batimentos/min, com um incremento de 100 batimentos/min; adquirir os ciclos ao longo de 5 min a cada taxa de ritmo.

6. Calibração salina e calibração do fluxo aórtico

1. Inativar o ventilador e administrar 5-10 μL de solução salina hipertônica por via intravenosa através do cateter CV.
2. Documente as flutuações de pressão e volume durante a injeção de soro fisiológico e calcule o valor de Vp usando o PowerLab ^3,11.
3. Repita a calibração do soro fisiológico para aumentar a precisão e a reprodutibilidade.
4. Vire o mouse para o lado esquerdo para não atrapalhar o sinal de volume.
5. Realizar toracotomia lateral entre Th3 a Th5 em direção à coluna vertebral e dissecar suavemente uma pequena parte da aorta descendente com pinças.
6. Coloque uma sonda de fluxo vascular (ver Tabela de Materiais) sobre a aorta para medir o débito cardíaco.
   NOTA: O cálculo preciso do volume absoluto requer o uso de dois tipos de calibração: calibração salina e calibração do fluxo aórtico. É importante reconhecer os riscos potenciais associados a uma infusão de solução salina hipertônica em animais, pois a carga excessiva de sal pode resultar em um declínio na contratilidade.

7. Eutanásia

1. Após o estudo, eutanasiar os camundongos sob uma overdose de anestésico via luxação cervical.
   NOTA: Para garantir a cessação completa da função vital, um método secundário de eutanásia é empregado, como a exsanguinação sob anestesia com subsequente coleta de tecido cardíaco.

Resultados

Os dados basais da alça PV são exibidos na Figura 1 e na Tabela 1. No início do estudo (na ausência de estimulação), não houve diferenças significativas em parâmetros diastólicos, como a constante de tempo de relaxamento (Tau), a taxa mínima de mudança de pressão (dP/dt min) e EDPVR entre os camundongos controle e HFpFEP. No entanto, os camundongos HFpEF exibiram pressão arterial e pressão arterial (Ea) mais elevadas, como mostrado na Figu...

Discussão

Apresentamos uma metodologia para avaliar as relações pressão-volume com a aplicação da estimulação transesofágica. A intolerância ao exercício é uma das principais características da ICFEP, porém não existem técnicas disponíveis para a avaliação da função cardíaca em camundongos durante o exercício. Nosso protocolo de estimulação artificial oferece uma ferramenta valiosa para detectar disfunção diastólica, que pode não ser aparente em condições de repouso.

Para o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies