Методика оценки диастолических функций, зависящих от частоты сердечных сокращений, в мышиных моделях сердечной недостаточности

Резюме

В настоящем протоколе описывается получение соотношения давления и объема с помощью чреспищеводной стимуляции, которая служит ценным инструментом для оценки диастолической функции в мышиных моделях сердечной недостаточности.

Аннотация

Сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) – состояние, характеризующееся диастолической дисфункцией и непереносимостью физической нагрузки. В то время как гемодинамические тесты с физической нагрузкой или МРТ могут быть использованы для выявления диастолической дисфункции и диагностики СНпФВ у людей, такие методы ограничены в фундаментальных исследованиях с использованием мышиных моделей. Для этой цели на мышах обычно используется тест с нагрузкой на беговой дорожке, но на его результаты может влиять масса тела, сила скелетных мышц и психическое состояние. В этой статье мы опишем протокол стимуляции предсердий для выявления зависимых от частоты сердечных сокращений (ЧСС) изменений диастолической производительности и проверки его полезности на мышиной модели СНпФВ. Метод включает в себя анестезию, интубацию и проведение анализа контура давления-объема (PV) одновременно с кардиостимуляцией предсердий. В этой работе через апикальный доступ левого желудочка был введен катетер проводимости, а в пищевод был помещен катетер для стимуляции предсердий. Исходные петли PV были собраны до того, как ЧСС был замедлен ивабрадином. Петли PV собирали и анализировали с шагом ЧСС в диапазоне от 400 до 700 уд/мин с помощью кардиостимуляции предсердий. Используя этот протокол, мы наглядно продемонстрировали ЧСС-зависимые диастолические нарушения в метаболически индуцированной модели СНпФВ. Как постоянная времени релаксации (Tau), так и зависимость между конечным диастолическим давлением и объемом (EDPVR) ухудшались по мере увеличения ЧСС по сравнению с контрольными мышами. В заключение, этот протокол с контролем кардиостимуляции предсердий полезен для выявления сердечных дисфункций, зависящих от ЧСС. Это обеспечивает новый способ изучения основных механизмов диастолической дисфункции в мышиных моделях HFpEF и может помочь в разработке новых методов лечения этого состояния.

Введение

Сердечная недостаточность является ведущей причиной госпитализации и смерти во всем мире, а сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) составляет около 50% всех диагнозов сердечной недостаточности. СНпФВ характеризуется диастолической дисфункцией и нарушением толерантности к физической нагрузке, а связанные с этим гемодинамические нарушения, такие как диастолическая дисфункция, могут быть четко выявлены с помощью гемодинамического тестирования с физической нагрузкой или МРТ ^1,2.

Однако в экспериментальных моделях доступные методы оценки физиологических аномалий, связанных с СНпФВ, ограничены ^3,4. Нагрузочное тестирование на беговой дорожке (TMT) используется для определения времени бега и дистанции, что может отражать сердечную гемодинамику при физической нагрузке; Однако этот метод подвержен влиянию внешних переменных, таких как масса тела, сила скелетных мышц и психическое состояние.

Чтобы обойти эти ограничения, мы разработали протокол стимуляции предсердий, который выявляет тонкие, но важные изменения в диастолической производительности на основе частоты сердечных сокращений (ЧСС) и подтвердили его полезность на мышиной модели HFpEF⁵. Несколько физиологических факторов влияют на сердечную функцию, связанную с физической нагрузкой, включая реакцию симпатического нерва и катехоламинов, периферическую вазодилатацию, эндотелиальную реакцию и частоту сердечных сокращений⁶. Среди них, однако, зависимость ЧСС от давления (также называемая эффектом Боудича) известна как критическая детерминанта физиологических характеристик сердца ^7,8,9.

Протокол включает в себя проведение традиционного анализа давления и объема на исходном уровне для оценки систолической и диастолической функции, включая такие параметры, как скорость развития давления (dp/dt), зависимость конечного систолического давления к объему (ESPVR) и зависимость конечного диастолического давления к объему (EDPVR). Однако следует отметить, что на эти параметры влияет ЧСС, который может варьироваться у разных животных из-за различий в их собственной частоте сердечных сокращений. Кроме того, следует учитывать влияние анестезии на ЧСС. Чтобы решить эту проблему, ЧСС была стандартизирована путем одновременного введения кардиостимуляции предсердий с ивабрадином, а измерения сердечных параметров проводились с увеличением частоты сердечных сокращений. Примечательно, что ЧСС-зависимый сердечный ответ отличал мышей с СНпФВ от мышей контрольной группы, в то время как существенных различий в исходных измерениях петли ПВ (с использованием собственной частоты сердечных сокращений^{) не} наблюдалось5.

Несмотря на то, что этот протокол может показаться относительно сложным, его успешность превышает 90%, если он хорошо изучен. Этот протокол обеспечит полезный способ изучения основных механизмов диастолической дисфункции в мышиных моделях HFpEF и поможет в разработке новых методов лечения этого состояния.

протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию и соответствовал правилам проведения экспериментов на животных и связанных с ними мероприятий в Токийском университете. Для настоящего исследования использовались 8-12-недельные самцы мышей C57/Bl6J. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Модель HFpEF была создана путем введения диеты с высоким содержанием жиров в течение 15 недель в сочетании с NG-нитро-L-аргинин-метиловым эфиром, как описано ранее¹⁰.

1. Подготовка катетеров и калибровка давления/объема

1. Поместите катетер проводимости в обычный физиологический раствор и прикрепите его к модулю, состоящему из PowerLab 8/35 и блока давления-объема (модуль MPVS, см. таблицу материалов).
2. Электронная калибровка давления и объема путем регистрации заданных параметров давления (0 мм рт. ст. и 100 мм рт. ст.) и объема (они различаются в разных модулях MPVS) на модуле MPVS ^3,11 (см. также инструкции производителя).

2. Подготовка животного к катетеризации

1. Анестезия и вентиляция легких
   1. За 5-10 мин до интубации вводят внутрибрюшинную инъекцию 5 мг/кг этимидата и 500 мг/кг уретана (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уретан, хотя и эффективен в качестве анестетика в исследованиях на животных, подозревается, что он канцероген для человека. Поэтому, когда уретан необходим для достижения экспериментальных целей и альтернативных агентов недостаточно, с ним следует обращаться с осторожностью. Обязательны соответствующие меры защиты, такие как ношение перчаток и масок, а также использование вытяжного шкафа во время подготовки. В качестве возможной альтернативы может быть использован кетамин (80 мг/кг, ip).
   2. Поместите мышь в наркозную камеру, предварительно насыщенную 2% изофлураном, и переложите животное на предварительно разогретую грелку при температуре от 38 °C до 40 °C после введения анестезии.
   3. Побрейте прооперированную область. Затем продезинфицируйте место операции тремя чередующимися приемами бетадина и спирта.
   4. Сделайте горизонтальный разрез (1-2 см) на шее, иссеките мышцу трахеи и обнажите трахею. Наложите хирургический шелковый шов 2-0 под трахею, приподнимите ее и сделайте небольшой разрез (1-2 мм), чтобы открыть ее.
   5. Вставьте эндотрахеальную трубку в трахею и подключите ее к аппарату искусственной вентиляции легких, который подает смесь 100% кислорода и 2% изофлурана (позже снижается до 0,5-1%).
2. Введение центрального венозного катетера (CV) и введение жидкости
   1. Найдите внутреннюю яремную вену под грудино-ключично-сосцевидной мышцей³.
   2. В яремную вену вводят центральный венозный катетер, состоящий из силастической трубки из ПЭ-10 (см. таблицу материалов), прикрепленной к игле 30 G.
   3. Вводят болюсную инфузию 5-6 мкл/г массы тела 10% альбумин/NaCl в течение 3 мин с последующей постоянной скоростью инфузии 5-10 мкл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для предотвращения гипотензии, вызванной периферической вазодилатацией, вызванной анестезией. Внутренняя яремная вена расположена между грудино-ключично-сосцевидной мышцей и сонной артерией и имеет более темный цвет, чем артерия.

3. Хирургическая процедура катетеризации левого желудочка (открытый грудной доступ)

1. Побрейте прооперированную область мыши, находящейся под наркозом. Затем продезинфицируйте место операции тремя чередующимися приемами бетадина и спирта.
2. Подтвердите глубину анестезии, выполнив защемление пальца ноги. Затем делают горизонтальный разрез (на 2-3 см) ниже мечевидного отростка, и отделяют кожу от грудной стенки тупыми ножницами.
3. Разрежьте грудную стенку латерально с обеих сторон с помощью электрического прижигания (см. Таблицу материалов).
4. Обнажите сердце, разрезав диафрагму, и аккуратно извлеките перикард из сердца с помощью щипцов.
5. Введите иглу 27 G в верхушку левого желудочка (ЛЖ) и ретроградно введите катетер проводимости в ЛЖ через отверстие для прокола.
6. Отрегулируйте положение катетера таким образом, чтобы получилась петля давления и объема квадратной формы.
7. Убедитесь, что катетер не контактирует с папиллярной мышцей при изменении условий нагрузки, проверив форму петли PV во время окклюзии нижней полой вены (IVC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адекватная нагрузка на сердце облегчает процедуру и помогает получить четкое изображение.

4. Регистрация данных петли PV и определение соотношения конечного систолического давления к объему (ESPVR) и соотношения конечного диастолического давления к объему (EDPVR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшение предварительного натяга за счет окклюзии IVC позволяет определить ESPVR и EDPVR.

1. Запись и анализ контура базового давления и объема (PV) с помощью программного обеспечения LabChart (см. Таблицу материалов), PowerLab и модуля MPVS после стабилизации сигнала (через 5-10 минут после кануляции).
2. Выполняйте окклюзию IVC, сжимая IVC щипцами, и записывайте петлю PV в течение не менее 20 сердечных циклов во время окклюзии IVC. Определите ESPVR путем аппроксимации линейной линии регрессии через конечные систолические точки петли PV и EDPVR путем подгонки криволинейной линии через конечные диастолические точки петли PV с помощью программного обеспечения LabChart.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остановите аппарат искусственной вентиляции легких во время окклюзии IVC, чтобы предотвратить артефакты движения легких. Паралитическое средство, такое как панкуроний (0,5-1 мг/кг), может быть полезным при чрезмерной подвижности легких и должно использоваться только после подтверждения стабильной анестезирующей плоскости.

5. Чреспищеводная кардиостимуляция

1. Введите в пищевод тетраполярный электродный катетер 2-Fr, подключите катетер к импульсному стимулятору (см. таблицу материалов) и определите порог захвата предсердий (в норме амплитуда стимула составляет 3 мА, а длительность импульса — 1 мс).
2. Замедлите ЧСС ниже 400 уд/мин, используя 20 мг/кг ивабрадина (см. таблицу материалов), вводимого внутрибрюшинно.
3. После стабилизации приобретите 20 непрерывных сердечных циклов петель PV с разной частотой стимуляции от 400 уд/мин до 700 уд/мин с шагом 100 уд/мин; Выполняйте циклы в течение 5 минут при каждом темпе.

6. Калибровка физиологического раствора и калибровка аортального потока

1. Инактивируйте аппарат искусственной вентиляции легких и введите 5-10 мкл гипертонического физиологического раствора внутривенно через CV-катетер.
2. Задокументируйте колебания давления и объема во время инъекции физиологического раствора и рассчитайте значение Vp с помощью PowerLab ^3,11.
3. Повторите калибровку физиологического раствора, чтобы повысить точность и воспроизводимость.
4. Поверните мышь на левую сторону, чтобы не нарушить сигнал громкости.
5. Сделайте латеральную торакотомию между Th3 и Th5 по направлению к позвоночнику и аккуратно рассеките щипцами небольшую часть нисходящей аорты.
6. Поместите датчик сосудистого потока (см. Таблицу материалов) на аорту для измерения сердечного выброса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точный расчет абсолютного объема требует использования двух типов калибровки: калибровка физиологическим раствором и калибровка аортального потока. Важно осознавать потенциальные риски, связанные с гипертонической инфузией солевого раствора у животных, так как чрезмерная нагрузка солями может привести к снижению сократительной способности.

7. Эвтаназия

1. После исследования мышей усыпляют при передозировке анестетика через вывих шейки матки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения полного прекращения жизнедеятельности используется вторичный метод эвтаназии, такой как обескровливание под наркозом с последующим забором сердечной ткани.

Результаты

Базовые данные фотоэлектрической петли показаны на рисунке 1 и в таблице 1. На исходном уровне (при отсутствии кардиостимуляции) не было существенных различий в диастолических параметрах, таких как константа времени релаксации (Tau), минимальная скорость изменен...

Обсуждение

Представлена методика оценки зависимости давления от объема с применением чреспищеводной кардиостимуляции. Непереносимость физической нагрузки является одной из ключевых характеристик СНпФВ, однако не существует методов оценки сердечной функции у мышей во время физической нагрузк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies