Procédure contrôlée par la stimulation pour l’évaluation des fonctions diastoliques dépendantes de la fréquence cardiaque dans des modèles murins d’insuffisance cardiaque

Résumé

Le présent protocole décrit l’obtention de la relation pression-volume par la stimulation transœsophagienne, qui constitue un outil précieux pour évaluer la fonction diastolique dans des modèles murins d’insuffisance cardiaque.

Résumé

L’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) est une affection caractérisée par un dysfonctionnement diastolique et une intolérance à l’exercice. Alors que les tests hémodynamiques à l’effort ou l’IRM peuvent être utilisés pour détecter le dysfonctionnement diastolique et diagnostiquer l’HFpEF chez l’homme, ces modalités sont limitées dans la recherche fondamentale utilisant des modèles murins. Un test d’effort sur tapis roulant est couramment utilisé à cette fin chez la souris, mais ses résultats peuvent être influencés par le poids corporel, la force des muscles squelettiques et l’état mental. Nous décrivons ici un protocole de stimulation auriculaire permettant de détecter les changements de performance diastolique en fonction de la fréquence cardiaque (FC) et de valider son utilité dans un modèle murin d’HFpEF. La méthode implique l’anesthésie, l’intubation et la réalisation d’une analyse de la boucle pression-volume (PV) concomitante à la stimulation auriculaire. Dans ce travail, un cathéter de conductance a été inséré par une approche apicale ventriculaire gauche, et un cathéter de stimulation auriculaire a été placé dans l’œsophage. Les boucles PV de base ont été recueillies avant que la HR ne soit ralentie avec l’ivabradine. Les boucles PV ont été collectées et analysées à des incréments de FC allant de 400 bpm à 700 bpm via une stimulation auriculaire. À l’aide de ce protocole, nous avons clairement démontré l’insuffisance diastolique dépendante de la HR dans un modèle HFpEF induit métaboliquement. La constante de temps de relaxation (Tau) et la relation pression-volume en fin de diastolique (EDPVR) se sont détériorées à mesure que la FC augmentait par rapport aux souris témoins. En conclusion, ce protocole contrôlé par la stimulation auriculaire est utile pour détecter les dysfonctionnements cardiaques dépendants de la fréquence cardiaque. Il fournit une nouvelle façon d’étudier les mécanismes sous-jacents de la dysfonction diastolique dans des modèles murins HFpEF et peut aider à développer de nouveaux traitements pour cette maladie.

Introduction

L’insuffisance cardiaque représente l’une des principales causes d’hospitalisation et de décès dans le monde, et l’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) représente environ 50 % de tous les diagnostics d’insuffisance cardiaque. L’HFpEF est caractérisée par un dysfonctionnement diastolique et une altération de la tolérance à l’exercice, et les anomalies hémodynamiques associées, telles que le dysfonctionnement diastolique, peuvent être clairement détectées par des tests hémodynamiques soumis à l’effort ou des IRM ^1,2.

Dans les modèles expérimentaux, cependant, les modalités disponibles pour évaluer les anomalies physiologiques liées à l’HFpEF sont limitées ^3,4. Les tests d’effort sur tapis roulant (TMT) sont utilisés pour déterminer le temps et la distance de course, ce qui peut refléter l’hémodynamique cardiaque liée au stress exercé ; Cependant, cette méthode est susceptible d’être perturbée par des variables étrangères telles que le poids corporel, la force des muscles squelettiques et l’état mental.

Pour contourner ces limitations, nous avons mis au point un protocole de stimulation auriculaire qui détecte des changements subtils mais cruciaux dans les performances diastoliques en fonction de la fréquence cardiaque (FC) et avons validé son utilité dans un modèle murin de HFpEF⁵. Plusieurs facteurs physiologiques contribuent à la fonction cardiaque liée à l’exercice, notamment la réponse du nerf sympathique et des catécholamines, la vasodilatation périphérique, la réponse endothéliale et la fréquence cardiaque⁶. Parmi ceux-ci, cependant, la relation FC-pression (également appelée effet Bowditch) est connue comme un déterminant critique des caractéristiques physiologiques cardiaques ^7,8,9.

Le protocole consiste à effectuer une analyse conventionnelle pression-volume au départ pour évaluer la fonction systolique et diastolique, y compris des paramètres tels que le taux de développement de la pression (dp/dt), la relation pression-volume en fin de systolique (ESPVR) et la relation pression-volume en fin de diastolique (EDPVR). Cependant, il convient de noter que ces paramètres sont influencés par la FC, qui peut varier d’un animal à l’autre en raison des différences de fréquence cardiaque intrinsèque. De plus, les effets de l’anesthésie sur la RH doivent également être pris en compte. Pour remédier à ce problème, la fréquence cardiaque a été normalisée en administrant une stimulation auriculaire concomitante à l’ivabradine, et des mesures des paramètres cardiaques ont été effectuées à des fréquences cardiaques incrémentielles. Notamment, la réponse cardiaque dépendante de la FC distinguait les souris HFpEF des souris du groupe témoin, tandis qu’aucune différence significative n’a été observée dans les mesures de base de la boucle PV (en utilisant la fréquence cardiaque intrinsèque)⁵.

Bien que ce protocole de stimulation puisse sembler relativement compliqué, son taux de réussite dépasse les 90 % lorsqu’il est bien compris. Ce protocole fournirait un moyen utile d’étudier les mécanismes sous-jacents de la dysfonction diastolique dans des modèles murins HFpEF et aiderait au développement de nouveaux traitements pour cette maladie.

Protocole

Ce protocole sur les animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux et a suivi les réglementations relatives à l’expérimentation animale et aux activités connexes de l’Université de Tokyo. Pour la présente étude, des souris mâles C57/Bl6J âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Un modèle de HFpEF a été établi en administrant un régime riche en graisses pendant 15 semaines en conjonction avec de l’ester méthylique NG-nitro-L-arginine, comme décrit précédemment¹⁰.

1. Préparations de cathéters et étalonnage pression/volume

1. Placez un cathéter de conductance dans une solution saline normale et fixez-le à un module composé du PowerLab 8/35 et d’une unité pression-volume (module MPVS, voir le tableau des matériaux).
2. Calibrez électroniquement la pression et le volume grâce à l’enregistrement de paramètres de pression (0 mmHg et 100 mmHg) et de volume prédéterminés (ceux-ci varient selon les modules MPVS) sur le module MPVS ^3,11 (voir également les instructions du fabricant).

2. Préparation d’un animal pour le cathétérisme

1. Anesthésie et ventilation
   1. Administrer une injection intrapéritonéale de 5 mg/kg d’étomidate et de 500 mg/kg d’uréthane (voir le tableau des matériaux) 5 à 10 minutes avant l’intubation.
      REMARQUE : L’uréthane, bien qu’efficace en tant qu’agent anesthésique dans les études animales, est soupçonné d’être cancérogène pour l’homme. Par conséquent, lorsque l’uréthane est nécessaire à la réalisation d’objectifs expérimentaux et qu’aucun agent de remplacement ne suffit, il doit être manipulé avec prudence. Des mesures de protection appropriées, telles que le port de gants et de masques et l’utilisation d’une hotte pendant la préparation, sont obligatoires. Comme alternative possible, la kétamine (80 mg/kg, ip) pourrait être utilisée.
   2. Placez la souris dans une chambre d’anesthésie préalablement saturée d’isoflurane à 2 % et transférez l’animal dans un coussin chauffant préchauffé maintenu entre 38 °C et 40 °C lors de l’induction de l’anesthésie.
   3. Rasez la zone chirurgicale. Ensuite, désinfectez le site chirurgical avec trois cycles alternés de bétadine et d’alcool.
   4. Faites une incision horizontale (1 à 2 cm) dans le cou, excissez le muscle trachéal et exposez la trachée. Passez une suture chirurgicale en soie 2-0 sous la trachée, élevez-la et faites une petite incision (1-2 mm) pour l’ouvrir.
   5. Insérez un tube endotrachéal dans la trachée et connectez-le à un ventilateur qui délivre un mélange de 100 % d’oxygène et de 2 % d’isoflurane (réduit à 0,5 % à 1 % plus tard).
2. Insertion d’un cathéter veineux central (CV) et injection de liquide
   1. Localisez la veine jugulaire interne sous le muscle sterno-cléido-mastoïdien³.
   2. Insérez le cathéter veineux central, constitué d’une tubulure en silicone PE-10 (voir le tableau des matériaux) fixé à une aiguille de 30 G, dans la veine jugulaire.
   3. Administrer une perfusion en bolus de 5 à 6 μL/g de poids corporel de 10 % d’albumine/NaCl pendant 3 minutes, suivie d’un débit de perfusion constant de 5 à 10 μL/min.
      REMARQUE : Cette étape est cruciale pour prévenir l’hypotension résultant de la vasodilatation périphérique causée par l’anesthésie. La veine jugulaire interne est située entre le muscle sterno-cléido-mastoïdien et l’artère carotide, et elle apparaît de couleur plus foncée que l’artère.

3. Intervention chirurgicale pour cathétérisme ventriculaire gauche (approche thoracique ouverte)

1. Rasez la zone chirurgicale de la souris anesthésiée. Ensuite, désinfectez le site chirurgical avec trois cycles alternés de bétadine et d’alcool.
2. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en effectuant un pincement des orteils. Ensuite, faites une incision horizontale (2-3 cm) sous le processus xiphoïde et séparez la peau de la paroi thoracique à l’aide de ciseaux émoussés.
3. Coupez la paroi thoracique latéralement des deux côtés à l’aide d’un cautéris électrique (voir le tableau des matériaux).
4. Exposez le cœur en coupant le diaphragme et retirez doucement le péricarde du cœur à l’aide d’une pince.
5. Insérez une aiguille de 27 G dans l’apex du ventricule gauche (VG) et insérez rétrogradamment un cathéter de conductance dans le VG par le trou de ponction.
6. Ajustez la position du cathéter de manière à obtenir une boucle pression-volume de forme carrée.
7. Vérifier que le cathéter n’entre pas en contact avec le muscle papillaire lorsque des changements dans les conditions de charge se produisent en vérifiant la forme de l’anse PV lors de l’occlusion de la veine cave inférieure (IVC).
   REMARQUE : Une exposition cardiaque adéquate facilite la procédure et aide à obtenir une vue claire.

4. Enregistrement des données de la boucle PV et détermination de la relation pression-volume systolique en fin de course (ESPVR) et de la relation pression-volume en fin de diastolique (EDPVR)

REMARQUE : La réduction de la précharge par occlusion IVC permet de déterminer l’ESPVR et l’EDPVR.

1. Enregistrez et analysez la boucle pression-volume (PV) de base avec le logiciel LabChart (voir la table des matériaux), PowerLab et le module MPVS après la stabilisation du signal (5 à 10 min après la canulation).
2. Effectuez l’occlusion IVC en comprimant l’IVC avec une pince et enregistrez la boucle PV pendant au moins 20 cycles cardiaques pendant l’occlusion IVC. Déterminez l’ESPVR en ajustant une droite de régression linéaire passant par les points systoliques finaux de la boucle PV et l’EDPVR en ajustant une ligne curviligne passant par les points diastoliques finaux de la boucle PV à l’aide du logiciel LabChart.
   REMARQUE : Arrêtez le ventilateur pendant l’occlusion IVC pour éviter les artefacts de mouvement pulmonaire. Un agent paralysant comme le pancuronium (0,5-1 mg / kg) peut être utile lorsque le mouvement pulmonaire est excessif et ne doit être utilisé qu’après la confirmation d’un plan anesthésique stable.

5. Stimulation transœsophagienne

1. Insérez un cathéter à électrode tétrapolaire 2-Fr dans l’œsophage, connectez le cathéter à un stimulateur d’impulsions (voir le tableau des matériaux) et déterminez le seuil de capture auriculaire (normalement, l’amplitude du stimulus est de 3 mA et la largeur d’impulsion est de 1 ms).
2. Ralentir la fréquence cardiaque en dessous de 400 battements/min en utilisant 20 mg/kg d’ivabradine (voir le tableau des matériaux) administrés par voie intrapéritonéale.
3. Après la stabilisation, acquérir 20 cycles cardiaques continus de boucles PV à différentes cadences de stimulation de 400 battements/min à 700 battements/min, avec un incrément de 100 battements/min ; Acquérez les cycles sur 5 min à chaque cadence de stimulation.

6. Étalonnage de la solution saline et du débit aortique

1. Inactivez le ventilateur et administrez 5 à 10 μL de solution saline hypertonique par voie intraveineuse à travers le cathéter CV.
2. Documentez les fluctuations de pression et de volume pendant l’injection de solution saline et calculez la valeur Vp à l’aide de PowerLab ^3,11.
3. Répétez l’étalonnage de la solution saline pour améliorer la précision et la reproductibilité.
4. Tournez la souris sur le côté gauche afin de ne pas perturber le signal de volume.
5. Faites une thoracotomie latérale entre Th3 et Th5 vers la colonne vertébrale et disséquez doucement une petite partie de l’aorte descendante avec une pince.
6. Placez une sonde de débit vasculaire (voir le tableau des matériaux) sur l’aorte pour mesurer le débit cardiaque.
   REMARQUE : Le calcul précis du volume absolu nécessite l’utilisation de deux types d’étalonnage : l’étalonnage salin et l’étalonnage du débit aortique. Il est important de reconnaître les risques potentiels associés à une perfusion de solution saline hypertonique chez les animaux, car une charge excessive en sel peut entraîner une diminution de la contractilité.

7. Euthanasie

1. Après l’étude, euthanasier les souris sous anesthésie par surdosage par luxation cervicale.
   REMARQUE : Pour assurer l’arrêt complet de la fonction vitale, une méthode secondaire d’euthanasie est utilisée, telle que l’exsanguination sous anesthésie suivie d’un prélèvement de tissu cardiaque.

Résultats

Les données de référence de la boucle PV sont présentées à la figure 1 et au tableau 1. Au départ (en l’absence de stimulation), il n’y avait pas de différences significatives dans les paramètres diastoliques tels que la constante de temps de relaxation (Tau), le taux minimum de changement de pression (dP/dt min) et l’EDPVR entre les souris témoins et HFpEF. Cependant, les souris HFpEF présentaient une pression artérielle et une élastance artérielle (Ea) ...

Discussion

Nous présentons une méthodologie permettant d’évaluer les relations pression-volume avec l’application de la stimulation transœsophagienne. L’intolérance à l’exercice est l’une des principales caractéristiques de l’HFpEF, mais il n’existe aucune technique permettant d’évaluer la fonction cardiaque chez la souris pendant l’exercice. Notre protocole de stimulation offre un outil précieux pour détecter un dysfonctionnement diastolique, qui peut ne pas être apparent dans des conditions de repos.<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies