Ein schrittmachergesteuertes Verfahren zur Beurteilung herzfrequenzabhängiger diastolischer Funktionen in murinen Herzinsuffizienzmodellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Bestimmung der Druck-Volumen-Beziehung durch transösophageale Stimulation, die als wertvolles Werkzeug zur Beurteilung der diastolischen Funktion in Mausmodellen der Herzinsuffizienz dient.

Zusammenfassung

Die Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) ist eine Erkrankung, die durch diastolische Dysfunktion und Belastungsintoleranz gekennzeichnet ist. Während belastungsbelastete hämodynamische Tests oder MRT verwendet werden können, um diastolische Funktionsstörungen zu erkennen und HFpEF beim Menschen zu diagnostizieren, sind solche Modalitäten in der Grundlagenforschung mit Mausmodellen begrenzt. Ein Laufband-Belastungstest wird häufig zu diesem Zweck bei Mäusen verwendet, aber seine Ergebnisse können durch das Körpergewicht, die Skelettmuskelkraft und den mentalen Zustand beeinflusst werden. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Vorhofstimulationsprotokoll zur Erkennung von herzfrequenzabhängigen Veränderungen der diastolischen Leistung und zur Validierung seiner Nützlichkeit in einem Mausmodell der HFpEF. Die Methode umfasst die Anästhesie, Intubation und die Durchführung einer Druck-Volumen-Schleifenanalyse (PV) in Verbindung mit einer Vorhofstimulation. In dieser Arbeit wurde ein Leitleitungskatheter über einen linksventrikulären apikalen Zugang eingeführt und ein Vorhofschrittkatheter in die Speiseröhre gelegt. Ausgangs-PV-Schleifen wurden gesammelt, bevor die Herzfrequenz mit Ivabradin verlangsamt wurde. PV-Schleifen wurden gesammelt und in HF-Schritten von 400 bpm bis 700 bpm mittels Vorhofstimulation analysiert. Mit Hilfe dieses Protokolls konnten wir eine HR-abhängige diastolische Beeinträchtigung in einem metabolisch induzierten HFpEF-Modell eindeutig nachweisen. Sowohl die Relaxationszeitkonstante (Tau) als auch die enddiastolische Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR) verschlechterten sich mit steigender Herzfrequenz im Vergleich zu Kontrollmäusen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Vorhofstimulations-gesteuerte Protokoll für die Erkennung von HR-abhängigen Herzfunktionsstörungen nützlich ist. Es bietet eine neue Möglichkeit, die zugrunde liegenden Mechanismen der diastolischen Dysfunktion in HFpEF-Mausmodellen zu untersuchen und könnte dazu beitragen, neue Behandlungen für diese Erkrankung zu entwickeln.

Einleitung

Herzinsuffizienz ist weltweit eine der Hauptursachen für Krankenhausaufenthalte und Todesfälle, und Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) macht etwa 50 % aller Herzinsuffizienzdiagnosen aus. Die HFpEF ist durch eine diastolische Dysfunktion und eine beeinträchtigte Belastungstoleranz gekennzeichnet, und die damit verbundenen hämodynamischen Anomalien, wie z. B. die diastolische Dysfunktion, können durch belastungsbelastete hämodynamische Tests oder MRT-Scans eindeutig nachgewiesen werden ^1,2.

In experimentellen Modellen sind die verfügbaren Modalitäten zur Beurteilung der physiologischen Anomalien im Zusammenhang mit HFpEF jedoch begrenzt ^3,4. Laufband-Belastungstests (TMT) werden verwendet, um die Laufzeit und Distanz zu bestimmen, die die Herzhämodynamik bei Belastung widerspiegeln können. Diese Methode ist jedoch anfällig für Störungen durch externe Variablen wie das Körpergewicht, die Skelettmuskelkraft und den mentalen Status.

Um diese Einschränkungen zu umgehen, haben wir ein Vorhofstimulationsprotokoll entwickelt, das subtile, aber entscheidende Veränderungen der diastolischen Leistung auf der Grundlage der Herzfrequenz (HF) erkennt und seine Nützlichkeit in einem Mausmodell von HFpEF⁵ validiert. Mehrere physiologische Faktoren tragen zur belastungsbedingten Herzfunktion bei, darunter die sympathische Nerven- und Katecholaminantwort, die periphere Vasodilatation, die Endothelantwort und die Herzfrequenz⁶. Unter diesen ist jedoch die HR-Druck-Beziehung (auch Bowditch-Effekt genannt) als kritische Determinante kardialer physiologischer Merkmale bekannt ^7,8,9.

Das Protokoll beinhaltet die Durchführung einer konventionellen Druck-Volumen-Analyse zu Studienbeginn, um die systolische und diastolische Funktion zu beurteilen, einschließlich Parametern wie der Druckentwicklungsrate (dp/dt), der endsystolischen Druck-Volumen-Beziehung (ESPVR) und der enddiastolischen Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR). Es ist jedoch zu beachten, dass diese Parameter von der Herzfrequenz beeinflusst werden, die aufgrund von Unterschieden in ihrer intrinsischen Herzfrequenz zwischen den Tieren variieren kann. Darüber hinaus sollten auch die Auswirkungen der Anästhesie auf die Herzfrequenz berücksichtigt werden. Um diesem Problem entgegenzuwirken, wurde die Herzfrequenz standardisiert, indem gleichzeitig mit Ivabradin eine atriale Stimulation verabreicht wurde, und kardiale Parametermessungen wurden mit inkrementellen Herzfrequenzen durchgeführt. Bemerkenswert ist, dass die HFpEF-Mäuse durch die HR-abhängige kardiale Reaktion von den Mäusen der Kontrollgruppe unterschieden, während bei den PV-Loop-Messungen zu Studienbeginn (unter Verwendung der intrinsischen Herzfrequenz) keine signifikanten Unterschiede beobachtet ^wurden5.

Obwohl dieses Pacing-Protokoll relativ kompliziert erscheinen mag, liegt seine Erfolgsquote bei über 90 %, wenn es gut verstanden wird. Dieses Protokoll würde eine nützliche Möglichkeit bieten, die zugrunde liegenden Mechanismen der diastolischen Dysfunktion in HFpEF-Mausmodellen zu untersuchen und bei der Entwicklung neuer Behandlungen für diese Erkrankung zu helfen.

Protokoll

Dieses Tierprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprach den Vorschriften für Tierversuche und verwandte Aktivitäten an der Universität Tokio. Für die vorliegende Studie wurden 8-12 Wochen alte männliche C57/Bl6J-Mäuse verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Ein Modell der HFpEF wurde durch die Verabreichung einer fettreichen Diät für 15 Wochen in Verbindung mit NG-Nitro-L-Argininmethylester etabliert, wie zuvor beschrieben¹⁰.

1. Katheterpräparationen und Druck-/Volumenkalibrierung

1. Legen Sie einen Leitfähigkeitskatheter in normale Kochsalzlösung und befestigen Sie ihn an einem Modul, bestehend aus dem PowerLab 8/35 und einer Druck-Volumen-Einheit (MPVS-Modul, siehe Materialtabelle).
2. Elektronische Kalibrierung von Druck und Volumen durch die Aufzeichnung von vorgegebenen Druck- (0 mmHg und 100 mmHg) und Volumenparametern (diese variieren zwischen MPVS-Modulen) auf dem MPVS-Modul ^3,11 (siehe auch Herstellerangaben).

2. Vorbereitung eines Tieres für die Katheterisierung

1. Anästhesie und Beatmung
   1. Verabreichen Sie 5-10 Minuten vor der Intubation eine intraperitoneale Injektion von 5 mg/kg Etomidat und 500 mg/kg Urethan (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Obwohl Urethan in Tierversuchen als Anästhetikum wirksam ist, steht es im Verdacht, für den Menschen krebserregend zu sein. Wenn Urethan zur Erreichung der Versuchsziele erforderlich ist und keine Alternativmittel ausreichen, muss daher mit Vorsicht umgegangen werden. Geeignete Schutzmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und Masken sowie die Verwendung eines Abzugs während der Zubereitung, sind vorgeschrieben. Als mögliche Alternative könnte Ketamin (80 mg/kg, ip) eingesetzt werden.
   2. Legen Sie die Maus in eine Anästhesiekammer, die zuvor mit 2 % Isofluran gesättigt war, und legen Sie das Tier auf ein vorgewärmtes Heizkissen, das nach der Einleitung der Anästhesie zwischen 38 °C und 40 °C gehalten wird.
   3. Rasieren Sie den Operationsbereich. Desinfizieren Sie dann die Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Betadin und Alkohol.
   4. Machen Sie einen horizontalen Schnitt (1-2 cm) im Hals, entfernen Sie den Trachealmuskel und legen Sie die Luftröhre frei. Führen Sie eine chirurgische 2-0-Seidennaht unter die Luftröhre, heben Sie sie an und machen Sie einen kleinen Schnitt (1-2 mm), um sie zu öffnen.
   5. Führen Sie einen Endotrachealtubus in die Luftröhre ein und schließen Sie ihn an ein Beatmungsgerät an, das eine Mischung aus 100 % Sauerstoff und 2 % Isofluran abgibt (später auf 0,5 % bis 1 % reduziert).
2. Einführen eines zentralvenösen Katheters (CV) und Flüssigkeitsinjektion
   1. Lokalisieren Sie die Vena jugularis interna unterhalb des Musculus sternocleidomastoideus³.
   2. Der zentrale Venenkatheter, bestehend aus einem PE-10-Silastikschlauch (siehe Materialtabelle), der an einer 30-G-Nadel befestigt ist, wird in die Jugularvene eingeführt.
   3. Verabreichen Sie eine Bolusinfusion von 5-6 μl/g Körpergewicht von 10 % Albumin/NaCl über 3 Minuten, gefolgt von einer konstanten Infusionsrate von 5-10 μl/min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine Hypotonie zu verhindern, die sich aus der durch die Anästhesie verursachten peripheren Vasodilatation ergibt. Die Vena jugularis interna befindet sich zwischen dem Musculus sternocleidomastoideus und der Halsschlagader und erscheint dunkler als die Arterie.

3. Chirurgischer Eingriff bei linksventrikulärer Katheterisierung (offener Thoraxzugang)

1. Rasieren Sie den Operationsbereich der betäubten Maus. Desinfizieren Sie dann die Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Betadin und Alkohol.
2. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen. Machen Sie dann einen horizontalen Schnitt (2-3 cm) unterhalb des Processus xiphoideus und trennen Sie die Haut mit einer stumpfen Schere von der Brustwand.
3. Schneiden Sie die Brustwand seitlich auf beiden Seiten mit Elektrokauter durch (siehe Materialtabelle).
4. Legen Sie das Herz frei, indem Sie das Zwerchfell durchschneiden, und entfernen Sie den Herzbeutel vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Herzen.
5. Führen Sie eine 27-G-Nadel in die Spitze des linken Ventrikels (LV) ein und führen Sie retrograd einen Leitfähigkeitskatheter über das Punktionsloch in den LV ein.
6. Stellen Sie die Katheterposition so ein, dass eine quadratische Druck-Volumen-Schleife entsteht.
7. Stellen Sie sicher, dass der Katheter den Papillarmuskel nicht berührt, wenn sich die Belastungsbedingungen ändern, indem Sie die Form der PV-Schleife während des Verschlusses der unteren Hohlvene (IVC) überprüfen.
   HINWEIS: Eine ausreichende Exposition des Herzens erleichtert den Eingriff und hilft, eine klare Sicht zu erhalten.

4. Aufzeichnen von PV-Schleifendaten und Bestimmung der endsystolischen Druck-Volumen-Beziehung (ESPVR) und der enddiastolischen Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR)

HINWEIS: Die Reduzierung der Vorlast durch IVC-Okklusion ermöglicht die Bestimmung der ESPVR und EDPVR.

1. Aufzeichnen und analysieren Sie die Basis-Druck-Volumen-Schleife (PV) mit der LabChart-Software (siehe Materialtabelle), PowerLab und dem MPVS-Modul nach der Signalstabilisierung (5-10 Minuten nach der Kanüle).
2. Führen Sie eine IVC-Okklusion durch, indem Sie die IVC mit einer Pinzette komprimieren, und zeichnen Sie die PV-Schleife während der IVC-Okklusion für mindestens 20 Herzzyklen auf. Bestimmen Sie die ESPVR, indem Sie eine lineare Regressionslinie durch die systolischen Endpunkte der PV-Schleife anpassen, und die EDPVR, indem Sie eine gekrümmte Linie durch die enddiastolischen Punkte der PV-Schleife mit der LabChart-Software anpassen.
   HINWEIS: Stoppen Sie das Beatmungsgerät während des IVC-Verschlusses, um Lungenbewegungsartefakte zu vermeiden. Ein paralytisches Mittel wie Pancuronium (0,5-1 mg/kg) kann bei übermäßiger Lungenbewegung hilfreich sein und sollte erst angewendet werden, wenn eine stabile Anästhesieebene bestätigt wurde.

5. Transösophageale Stimulation

1. Führen Sie einen 2-Fr-Katheter mit tetrapolaren Elektroden in die Speiseröhre ein, schließen Sie den Katheter an einen Pulsstimulator an (siehe Materialtabelle) und bestimmen Sie die Schwelle für den atrialen Einfang (normalerweise beträgt die Stimulusamplitude 3 mA und die Pulsbreite 1 ms).
2. Verlangsamen Sie die Herzfrequenz unter 400 Schläge/min mit 20 mg/kg Ivabradin (siehe Materialtabelle), das intraperitoneal verabreicht wird.
3. Nach der Stabilisierung werden 20 kontinuierliche Herzzyklen von PV-Schleifen mit unterschiedlichen Schrittraten von 400 Schlägen/min bis 700 Schlägen/min mit einem Inkrement von 100 Schlägen/min erfasst. Erfassen Sie die Zyklen über 5 Minuten bei jeder Schrittfrequenz.

6. Kalibrierung von Kochsalzlösung und Aortenfluss

1. Deaktivieren Sie das Beatmungsgerät und verabreichen Sie 5-10 μl hypertone Kochsalzlösung intravenös über den CV-Katheter.
2. Dokumentieren Sie die Druck- und Volumenschwankungen während der Kochsalzinjektion und berechnen Sie den Pp-Wert mit PowerLab ^3,11.
3. Wiederholen Sie die Kochsalzkalibrierung, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern.
4. Drehen Sie die Maus auf die linke Seite, um das Lautstärkesignal nicht zu stören.
5. Machen Sie eine laterale Thorakotomie zwischen Th3 und Th5 in Richtung Wirbelsäule und präparieren Sie vorsichtig einen kleinen Teil der absteigenden Aorta mit einer Pinzette.
6. Platzieren Sie eine Gefäßflusssonde (siehe Materialtabelle) über der Aorta, um das Herzzeitvolumen zu messen.
   HINWEIS: Die genaue Berechnung des absoluten Volumens erfordert die Verwendung von zwei Arten der Kalibrierung: die Kalibrierung von Kochsalzlösung und die Kalibrierung des Aortenflusses. Es ist wichtig, die potenziellen Risiken zu erkennen, die mit einer hypertonen Kochsalzinfusion bei tierischen Probanden verbunden sind, da eine übermäßige Salzbelastung zu einer Abnahme der Kontraktilität führen kann.

7. Euthanasie

1. Nach der Studie werden die Mäuse unter einer Überdosis Anästhesie durch Zervixluxation eingeschläfert.
   HINWEIS: Um die vollständige Beendigung der Vitalfunktion zu gewährleisten, wird eine sekundäre Methode der Euthanasie angewendet, wie z. B. die Blutung unter Narkose mit anschließender Entnahme von Herzgewebe.

Ergebnisse

Die Basisdaten des PV-Loops sind in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Zu Studienbeginn (ohne Stimulation) gab es keine signifikanten Unterschiede in den diastolischen Parametern wie der Relaxationszeitkonstante (Tau), der minimalen Druckänderungsrate (dP/dt min) und der EDPVR zwischen den Kontroll- und HFpEF-Mäusen. Die HFpEF-Mäuse wiesen jedoch einen höheren Blutdruck und eine höhere arterielle Elastanz (Ea) auf, wie in Abbildung 1 ge...

Diskussion

Wir stellen eine Methodik zur Beurteilung von Druck-Volumen-Beziehungen bei der Anwendung der transösophagealen Stimulation vor. Belastungsintoleranz ist eines der Hauptmerkmale der HFpEF, jedoch gibt es keine Techniken zur Beurteilung der Herzfunktion bei Mäusen während des Trainings. Unser Stimulationsprotokoll bietet ein wertvolles Werkzeug zur Erkennung diastolischer Dysfunktionen, die unter Ruhebedingungen möglicherweise nicht offensichtlich sind.

Um einen PV-Kreislauf von genauer und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies