Un modelo de rata de acné compuesto

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para inducir la inflamación del acné en la piel de rata con ácido oleico y Cutibacterium acnes.

Resumen

El acné vulgar es una afección crónica prevalente de la piel caracterizada por la presencia de comedones, pápulas y pústulas en la cara, el cuello y el pecho. Para simular la inflamación del acné vulgar, este protocolo detalla un enfoque para establecer un modelo compuesto de roedores con acné mediante la inducción de la inflamación del acné en orejas de rata utilizando ácido oleico y Cutibacterium acnes (C. acnes). Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: el grupo control normal (NC), las orejas tratadas con el grupo de ácido oleico (OA), las orejas tratadas con el grupo C. acnes (C. acnes), las orejas tratadas con ácido oleico y C. acnes (OA + C. acnes). Para imitar la producción excesiva de sebo, se untó ácido oleico en las orejas de ratas de los grupos OA y OA + C. acnes durante 25 días.

De los días 21 a 25, la suspensión de C. acnes se inyectó por vía intradérmica en los oídos de ratas de los grupos C. acnes y OA + C. acnes para agravar la inflamación del acné. El grosor de la oreja se midió semanalmente como un indicador de la gravedad de la inflamación. Se realizó observación macroscópica, tinción con hematoxilina y eosina, e inmunohistoquímica (IHQ) y los resultados mostraron que las orejas del grupo OA y del grupo OA + C. acnes estaban engrosadas e induradas, acompañadas de eritema y presencia de comedones. Además, se observaron pápulas en los grupos C. acnes y OA + C. acnes . La histopatología mostró hiperqueratinización e infundíbulo expandido de los folículos pilosos en los grupos OA y OA + C. acnes . Se encontraron infiltración de células inflamatorias y abscesos en la dermis de los grupos C. acnes y OA + C. acnes . Los resultados de IHQ confirmaron un aumento de los niveles de factor de necrosis tumoral (TNF)-α en la dermis de los grupos C . acnes y OA + C. acnes . Todos los resultados anteriores indicaron colectivamente el establecimiento exitoso del modelo compuesto de roedores con acné.

Introducción

El acné vulgar es una enfermedad crónica común de la piel caracterizada por la presencia de comedones, pápulas y pústulas en la cara, el cuello y el tórax, que, en casos graves, pueden progresar a nódulos, quistes y cicatrices permanentes¹. Los estudios epidemiológicos informan que el acné afecta al 9,4% de la población mundial, mientras que sus síntomas resultantes plantean graves desafíos físicos y psicosociales ^2,3.

La patogenia del acné es multifactorial, incluyendo cuatro procesos críticos: producción excesiva de sebo, formación de comedones, colonización folicular por la microbiota cutánea y liberación de mediadores inflamatorios alrededor de la unidad pilosebácea ^4,5. El aumento de la secreción de sebo, que resulta en la acumulación de un exceso de ácidos grasos libres insaturados (AGNI), contribuye a la reproducción anormal de la microbiota cutánea, una de las cuales es Cutibacterium acnes, como se ha demostrado en estudios genómicos⁶. Mientras tanto, la microbiota de la piel descompone el sebo y aumenta la concentración de UFFA, lo que conduce a un círculo vicioso⁷. Además, el exceso de UFFA provoca hiperqueratinización en los folículos pilosos, lo que a su vez desencadena el acné⁸. Tanto la microbiota cutánea como el aumento del sebo activan los receptores tipo Toll (TLR) para producir múltiples citocinas proinflamatorias, como la interleucina (IL)-1 y el TNF-α ^9,10. Esta cascada de inflamación, junto con el aumento del sebo y el crecimiento excesivo de microbios, culmina en una hiperqueratosis pronunciada del folículo piloso y la aparición de acné¹¹.

El rápido desarrollo en el campo de la investigación del acné y los requisitos clínicos relacionados ha impulsado la creación de una serie de modelos animales de inflamación del acné en la oreja de rata, el dorso de ratas o ratones y la oreja de conejo 12,13,14,15. Los métodos incluyen la inyección intradérmica de C. acné, la aplicación de aceites en la piel para simular la secreción anormal de las glándulas sebáceas y la hiperqueratinización, o una combinación de ambas para acelerar la inflamación de la piel y formar acné 16,17,18,19. Sin embargo, el uso y la dosis de agentes químicos y agentes biológicos varían entre los estudios anteriores, lo que puede confundir a los investigadores que intentan establecer un modelo apropiado para el acné. Este estudio tuvo como objetivo establecer un método fácil de operar y efectivo para formar un modelo compuesto de roedores con acné y proporcionar una referencia de modelo para los investigadores que estudian el acné vulgar.

Protocolo

Este protocolo ha recibido la aprobación ética de la Universidad de Medicina China de Beijing (No.2023033103-1183). En este protocolo se utilizaron doce ratas macho Sprague-Dawley (peso, 208 g ± 5 g) y se dividieron en cuatro grupos: grupo NC (n = 3), grupo OA (n = 3), grupo C. acnes (n = 3) y grupo OA + C. acnes (n = 3).

1. Desarrollo del modelo de acné

1. Mida y registre el grosor de las orejas de rata utilizando un calibrador electrónico vernier (consulte la tabla de materiales) antes de modelar.
   1. Coloque la mandíbula exterior del calibrador electrónico vernier en el punto medio del borde exterior de la oreja y extiéndala hasta el canal auditivo. Registre el grosor de 2/3 puntos y el grosor de 1/2 puntos a lo largo de la línea. Mida cada punto 3x y calcule los valores promedio del grosor de dos puntos para que se considere el grosor de la oreja.
2. Incline la cabeza de la rata hacia un lado, coloque la oreja hacia arriba y aplique 50 μL de ácido oleico (ver Tabla de materiales) en los lados ventral y dorsal de la oreja de manera uniforme, una vez al día, durante 25 días.
3. Desde el día 21 hasta el día 25, diariamente antes de la aplicación de ácido oleico, anestesiar a las ratas con isoflurano al 4% y luego inyectar 50 μL de suspensión de 1 × 10⁷ UFC C. acnes (ver Tabla de Materiales) por vía intradérmica en la superficie ventral del oído utilizando una jeringa de 1 mL equipada con una aguja de 34 G o 36 G (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Tenga cuidado de evitar los vasos sanguíneos en el oído cuando se inyecte por vía intradérmica. Se requiere una microjeringa con una aguja de 34 G o 36 G (ver Tabla de Materiales). Para garantizar una inyección intradérmica adecuada, la aguja debe perforarse en un ángulo de 10 a 15 grados, con una profundidad de aproximadamente 1 mm.
4. El día 25, mida y registre el grosor de las orejas, como se describe en el paso 1.1.
   NOTA: El grupo de OA solo se untó con ácido oleico como se describe en el paso 1.2 y se inyectó solución salina desde el día 21 hasta el día 25. El grupo de C. acnes solo se inyectó por vía intradérmica mediante la suspensión de C. acnes , como se describe en el paso 1.3. El grupo OA + C. acnes fue tratado con ácido oleico y suspensión de C. acnes , como se describe en los pasos 1.2 y 1.3.

2. Recolección y análisis de tejidos

1. El día 26, después de que las ratas sean sacrificadas humanamente utilizando un método aprobado institucionalmente, perfore el tamaño fijo en las orejas bilaterales con un taladro de anillo de 8 mm.
2. Sumerja los tejidos del oído en paraformaldehído al 4% durante 24 h, seguido de la inclusión en parafina y la sección en rodajas de 5 μm de grosor para la tinción con hematoxilina y eosina (HE)²⁰. Observe las secciones bajo un microscopio óptico y registre los cambios patológicos para la evaluación de seguimiento por parte de un patólogo. Asigne puntuaciones a los cambios patológicos de acuerdo con la Tabla 1 (ver también Figura 1).
3. Desparafinar, rehidratar y calentar las secciones para la recuperación del antígeno. Inactivar las peroxidasas endógenas incubando con 0,3% H₂O₂ en metanol durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Lave las secciones con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego incube con BSA al 3% durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Incubar las secciones con anticuerpo monoclonal TNF-α (dilución 1:800) (ver Tabla de Materiales) a 4 °C durante la noche.
6. Lavar las secciones con PBS nuevamente e incubar con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (ver Tabla de Materiales) durante 50 min.
7. Después de otro lavado con PBS, aplique la mezcla de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) a los portaobjetos y controle el proceso de tinción bajo un microscopio, deteniendo la reacción con PBS cuando se alcance la intensidad deseada.
8. Contramanche las secciones con hematoxilina de Meyer durante 1 min, enjuáguelas con agua corriente y deshidrate y monte las secciones. Observe las secciones bajo un microscopio y registre los cambios patológicos para la evaluación de seguimiento por parte de un patólogo.

3. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos.
2. Presentar los datos como media ± desviación estándar. Accede a la normalidad de todos los datos mediante el test de Shapro-Wilke. Si sigue una distribución normal, utilice el ANOVA de un factor para evaluar las diferencias significativas. Para datos distribuidos no normalmente, aplique la prueba de Kruskal-Wallis seguida de las comparaciones múltiples de Dunn. Un valor p inferior a 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados

Grosor y aspecto de la piel
Desde el día 7 hasta el día 21, las orejas en el grupo de OA y en el grupo de OA + C. acnes fueron significativamente más gruesas que las de los grupos NC y C. acnes . El día 25, las orejas del grupo OA, C . acnes y OA + C. acnes fueron significativamente más gruesas que las del grupo NC (p < 0,05). El grosor promedio de las orejas durante el experimento se muestra en la

Discusión

Dado que la metodología y los criterios de evaluación para un modelo de acné no estaban claros, este protocolo tenía como objetivo proporcionar una referencia para los investigadores que estudian el acné. Debido al pequeño tamaño de la oreja del ratón y la interferencia causada por el crecimiento de vello en la espalda, el uso de crema depilatoria y una afeitadora, la oreja de la rata puede ser una mejor alternativa para establecer un modelo de acné en roedores. Habíamos intent...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg