複合ニキビのラットモデル

要約

このプロトコルは、オレイン酸と Cutibacterium acnesを使用してラットの皮膚ににきびの炎症を誘発する手順を概説しています。

要約

尋常性ざ瘡は、顔、首、胸に面皰、丘疹、膿疱が存在することを特徴とする一般的な慢性皮膚疾患です。尋常性ざ瘡の炎症をシミュレートするために、このプロトコルでは、オレイン酸と Cutibacterium acnes (C.acnes)を使用してラットの耳ににきびの炎症を誘発することにより、複合にきびげっ歯類モデルを確立するアプローチについて詳しく説明します。ラットを4つのグループにランダムに分けました:正常対照群(NC)、オレイン酸群(OA)で治療された耳、 アクネス菌 グループ(C.アクネス)で治療された耳、オレイン酸と アクネ菌 (OA+ アクネス)で治療された耳。過剰な皮脂産生を模倣するために、オレイン酸をOAおよびOA+ C.acnes グループのラットの耳に25日間塗りました。

21日目から25日目にかけて、 アクネ菌 懸濁液を アクネ菌 群およびOA+ アクネス 菌群のラットの耳に皮内注射し、ニキビの炎症を悪化させた。耳の厚さは、炎症の重症度の尺度として毎週測定されました。肉眼観察、ヘマトキシリンとエオシンの染色、免疫組織化学(IHC)を行った結果、OA群と OA+アクネス菌 群の耳が肥厚して硬直し、紅斑や面皰の存在を伴ったことが示された。さらに、丘疹は C.acnes およびOA+ C.acnes グループで観察されました。組織病理学は、OAおよびOA+ C.アクネス 群の毛包の角質増殖および拡張を示した。炎症細胞および膿瘍の浸潤は 、アクネ菌 およびOA+ アクネス菌 群の真皮に認められた。IHCの結果により、 C.acnes およびOA+ C.acnes グループの真皮における腫瘍壊死因子(TNF)-αのレベルの増加が確認されました。上記のすべての結果は、複合にきびげっ歯類モデルの成功した確立をまとめて示しています。

概要

尋常性ざ瘡は、顔面、首、胸部に面皰、丘疹、膿疱が存在することを特徴とする一般的な慢性皮膚疾患であり、重症の場合、結節、嚢胞、永久的な瘢痕に進行する可能性があります¹。疫学研究によると、にきびは世界人口の9.4%に影響を及ぼし、その結果生じる症状は深刻な身体的および心理社会的課題をもたらします^2,3。

にきびの病因は多因子性であり、皮脂の過剰産生、面皰形成、皮膚微生物叢による卵胞のコロニー形成、および毛様皮脂腺ユニット^の周囲の炎症性メディエーターの放出という4つの重要なプロセスが含まれます^4,5。皮脂分泌の増加により、過剰な不飽和遊離脂肪酸(UFA)が蓄積すると、^{ゲノム研究で示され}ているように、皮膚微生物叢(その1つがアクネ菌)の異常な繁殖に寄与します6。一方、皮膚微生物叢は皮脂を分解し、UFFAの濃度を高めることで、悪循環に陥ります⁷。さらに、過剰なUFFAは毛包の角質増殖を引き起こし、それが次ににきび⁸を引き起こします。皮膚微生物叢と皮脂の増加はどちらもToll様受容体(TLR)を活性化し、インターロイキン(IL)-1やTNF-αなどの複数の炎症誘発性サイトカインを産生します^9,10。この炎症のカスケードは、皮脂の増加と微生物の異常増殖と相まって、毛包の顕著な角質増殖症とにきびの発症につながります¹¹。

にきび研究および関連した臨床条件の分野の急速な開発はラットの耳、ラットまたはマウスの背部およびウサギの耳12,13,14,15のにきびの炎症の一連の動物モデルの作成を運転した。方法には、Cの皮内注射が含まれます。にきび、皮脂腺の異常な分泌と角質増殖をシミュレートするための皮膚への油の塗布、または皮膚の炎症を加速してにきび16,17,18,19を形成するための両方の組み合わせ。ただし、化学薬品や生物剤の使用法と投与量は以前の研究によって異なり、適切なにきびモデルを確立しようとする研究者を混乱させる可能性があります。この研究は、複合にきびげっ歯類モデルを形成するための操作が簡単で効果的な方法を確立し、尋常性ざ瘡を研究する研究者にモデルリファレンスを提供することを目的としています。

プロトコル

このプロトコールは、北京中医薬大学(No.2023033103-1183)から倫理承認を受けています。このプロトコルでは、12匹の雄のSprague-Dawleyラット(体重、208g±5g)を使用し、NC群(n = 3)、OA群(n = 3)、 C.acnes 群(n = 3)およびOA+ C.acnes 群(n = 3)の4つのグループに分けました。

1. ニキビモデルの開発

1. モデリングの前に、電子ノギス( 材料の表を参照)を使用してラットの耳の厚さを測定し、記録します。
   1. 電子ノギスの外側の顎を耳の外縁の中点に置き、外耳道に伸ばします。線に沿って 2/3 ポイントの太さと 1/2 ポイントの太さを記録します。各ポイントを3回測定し、耳の厚さと見なされる2つのポイントの厚さの平均値を計算します。
2. ラットの頭を片側に傾け、耳を上に向けて、50μLのオレイン酸( 材料の表を参照)を耳の腹側と背側に1日1回、25日間均等に塗布します。
3. 21日目から25日目まで、オレイン酸を塗布する毎日前に、4%イソフルランを使用してラットに麻酔をかけ、次に50μLの1×10⁷ CFU C.アクネス 懸濁液( 材料の表を参照)を、34Gまたは36Gの針を備えた1mLシリンジを使用して耳の腹面に皮内に注射します( 材料の表を参照)。.
   注:皮内注射の際は、耳の血管に血管が入らないように注意してください。34Gまたは36Gの針が付いたマイクロシリンジが必要です( 材料の表を参照)。適切な皮内注射を確実にするために、針は10〜15度の角度で、深さは約1mmで穴を開ける必要があります。
4. 25日目に、ステップ1.1で説明したように、耳の厚さを測定して記録します。
   注:OA群は、ステップ1.2で説明したようにオレイン酸のみを塗抹し、21日目から25日目まで生理食塩水を注射しました。 C. acnes グループは、ステップ 1.3 で説明したように、 C. acnes 懸 ?? 液によって皮内注射されただけです。.OA+ アクネ菌 群を、ステップ1.2および1.3に記載したように、オレイン酸および アクネ菌 懸濁液で処理した。

2. 組織採取・解析

1. 26日目に、ラットが制度的に承認された方法を使用して人道的に安楽死させられた後、8mmリングドリルで両側の耳に固定サイズをドリルします。
2. 耳の組織を4%パラホルムアルデヒドに24時間浸し、続いてパラフィンを包埋し、厚さ5μmのスライスに切片化してヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色²⁰を行う。光学顕微鏡で切片を観察し、病理学的変化を記録して、病理医によるフォローアップ評価を行います。 表 1 に従って病理学的変化にスコアを割り当てます ( 図 1 も参照)。
3. 抗原賦活化のために切片を脱パラフィンし、再水和し、加熱します。内因性ペルオキシダーゼを不活性化するには、0.3% H₂O₂ とメタノール中で室温で 15 分間インキュベートします。
4. 切片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、3% BSAと室温で30分間インキュベートします。
5. 切片をTNF-αモノクローナル抗体(希釈率1:800)( 材料表を参照)と4°Cで一晩インキュベートします。
6. 切片を再びPBSで洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体( 材料表を参照)と50分間インキュベートします。
7. 別のPBS洗浄後、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)混合物をスライドに塗布し、顕微鏡で染色プロセスをモニターし、所望の強度に達したらPBSとの反応を停止します。
8. 切片をマイヤーのヘマトキシリンで1分間対比染色し、流水ですすぎ、切片を脱水してマウントします。切片を顕微鏡で観察し、病理学的変化を記録して、病理医によるフォローアップ評価を行います。

3. 統計分析

1. 統計分析を実行します。
2. データを平均±標準偏差として表示します。Shapro-Wilke検定を使用して、すべてのデータの正規性にアクセスします。正規分布に従う場合は、一元配置分散分析を使用して有意差を評価します。非正規分布データの場合は、Kruskal-Wallis 検定を適用し、その後に Dunn の多重比較を適用します。0.05未満の p値は、統計的に有意であると見なされます。

結果

厚さと肌の外観
7日目から21日目にかけて、OA群とOA+ アクネ菌 群の耳は、NC群と アクネス菌 群よりも有意に厚かった。25日目には、OA群、 C.acnes 群、OA+ C.acnes 群の耳はNC群よりも有意に厚かった(p < 0.05)。実験中の耳の平均厚さを 図2 と 表2に示します。

7日目から25...

ディスカッション

にきびモデルの方法論と評価基準が明確ではなかったため、このプロトコルはにきびを研究する研究者に参照を提供することを目的としていました。マウスの耳のサイズが小さいことと、背中の毛の成長、脱毛クリームとシェーバーの使用によって引き起こされる干渉のために、ラットの耳はにきびのげっ歯類モデルを確立するためのより良い代替手段かもしれませ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg