복합 여드름의 쥐 모델

요약

이 프로토콜은 올레산과 Cutibacterium 여드름으로 쥐 피부에 여드름 염증을 유도하는 절차를 설명합니다.

초록

심상성 여드름은 얼굴, 목, 가슴에 면포성, 구진, 농포가 있는 만성 피부 질환입니다. 심상성 여드름의 염증을 시뮬레이션하기 위해 이 프로토콜은 올레산과 Cutibacterium acnes (C. acnes)를 사용하여 쥐의 귀에 여드름 염증을 유도하여 복합 여드름 설치류 모델을 확립하는 접근 방식을 자세히 설명합니다. 쥐는 무작위로 정상 대조군(NC), 올레산기(OA)로 처리된 귀, C. 여드름 그룹(C. acnes)으로 처리된 귀, 올레산 및 C. 여드름 (OA + C. 여드름)으로 처리된 귀의 네 그룹으로 나뉘었습니다. 과도한 피지 생성을 모방하기 위해, 올레산을 OA 및 OA + C. 여드름 그룹의 쥐의 귀에 25일 동안 발랐습니다.

21일에서 25일까지, C. acnes 현탁액을 C. acnes 및 OA + C. acnes 그룹의 쥐의 귀에 피내로 주입하여 여드름 염증을 악화시켰다. 귀 두께는 염증의 중증도를 측정하기 위해 매주 측정되었습니다. 총체적 관찰, 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역조직화학(IHC)을 실시한 결과, OA 그룹과 OA + C. 여드름 그룹의 귀가 두꺼워지고 침전되어 홍반과 면포가 동반되는 것으로 나타났습니다. 또한, C. acnes 및 OA + C. acnes 그룹에서 구진이 관찰되었습니다. 조직병리학은 OA 및 OA + C. 여드름 그룹에서 모낭의 과각화(hyperkeratinization) 및 확장된 모낭 내(infundibulum)를 나타냈다. 염증 세포 및 농양의 침윤은 C. acnes 및 OA + C. acnes 그룹의 진피에서 발견되었습니다. IHC 결과는 C. 여드름 및 OA + C. 여드름 그룹의 진피에서 종양괴사인자(TNF)-α 수치가 증가했음을 확인했습니다. 위의 모든 결과는 종합적으로 복합 여드름 설치류 모델의 성공적인 설립을 나타냈습니다.

서문

심상성 여드름은 얼굴, 목, 가슴에 면포성, 구진, 농포가 있는 흔한 만성 피부 질환으로, 심한 경우 결절, 낭종, 영구적인 흉터로 진행될 수 있다¹. 역학 연구에 따르면 여드름은 전 세계 인구의 9.4%에 영향을 미치며 이로 인한 증상은 심각한 신체적, 심리사회적 문제를 야기합니다 ^2,3.

여드름의 발병은 과잉 피지 생성, 면포성 형성, 피부 미생물군에 의한 여포 집락화, 필로세바스 단위 ^4,5 주변의 염증 매개체 방출 등 4가지 중요한 과정을 포함하여 다요인적입니다. 피지 분비 증가로 인한 과도한 불포화 유리 지방산(UFPA)의 축적은 피부 미생물군의 비정상적인 증식에 기여하며, 그 중 하나가 유전체 연구에서 나타난 바와 같이 쿠티박테리움 여드름(Cutibacterium acnes)이다⁶. 한편, 피부 미생물총은 피지를 분해하고 UFFA의 농도를 증가시켜 악순환을 일으킨다⁷. 또한, 과도한 UFFA는 모낭에 과각화(hyperkeratinization)를 일으켜 여드름을 유발한다⁸. 피부 미생물군과 증가된 피지는 모두 톨 유사 수용체(TLR)를 활성화하여 인터루킨(IL)-1 및 TNF-α ^9,10과 같은 여러 전염증성 사이토카인을 생성합니다. 이러한 염증의 연쇄작용은 피지의 증가와 미생물의 과잉 증식과 함께 모낭의 뚜렷한 과각화증과 여드름의 발병으로 절정에 이른다¹¹.

여드름 연구 및 관련 임상 요구 사항 분야의 급속한 발전은 쥐 귀, 쥐 또는 생쥐의 등, 토끼 귀 12,13,14,15에 여드름 염증의 일련의 동물 모델의 생성을 주도했습니다. 이 방법에는 C의 피내 주사가 포함됩니다. 여드름, 피지선의 비정상적인 분비와 과각화를 시뮬레이션하기 위해 피부에 오일을 바르거나 피부 염증을 가속화하여 여드름을 형성하는 두 가지 조합 16,17,18,19. 그러나 화학 제제와 생물학적 제제의 사용법 및 복용량은 이전 연구에서 다양하여 적절한 여드름 모델을 확립하려는 연구자에게 혼란을 줄 수 있습니다. 이 연구는 복합 여드름 설치류 모델을 형성하기 위한 조작이 쉽고 효과적인 방법을 확립하고 심상성 여드름을 연구하는 연구자에게 모델 참조를 제공하는 것을 목표로 했습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 베이징 중의과대학(No.2023033103-1183)으로부터 윤리적 승인을 받았습니다. 12마리의 수컷 Sprague-Dawley 랫트(체중, 208g ± 5g)를 이 프로토콜에 사용하고 NC기(n=3), OA기(n=3), C. 여드름 기(n=3) 및 OA+ C. 여드름 기(n=3)의 4개 그룹으로 나누었다.

1. 여드름 모델 개발

1. 모델링하기 전에 전자 버니어 캘리퍼스( 재료 표 참조)를 사용하여 쥐 귀의 두께를 측정하고 기록하십시오.
   1. 전자 버니어 캘리퍼의 바깥쪽 턱을 귀 바깥쪽 가장자리의 중간 지점에 놓고 외이도로 확장합니다. 선을 따라 2/3 점의 두께와 1/2 점의 두께를 기록하십시오. 각 점을 3배 측정하고 귀의 두께로 간주되는 두 점의 두께의 평균값을 계산합니다.
2. 쥐의 머리를 한쪽으로 기울이고, 귀를 위로 향하게 하고, 50μL의 올레산( 재료 표 참조)을 하루에 한 번 귀의 복쪽과 등쪽에 25일 동안 고르게 바릅니다.
3. 21일째부터 25일째까지, 매일 올레산을 적용하기 전에 4% 이소플루란을 사용하여 쥐를 마취한 다음 34G 또는 36G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 귀의 복부 표면에 50 μL의 1 × 10⁷ CFU C. 여드름 현탁액( 재료 표 참조)을 피내로 주입합니다.
   알림: 피내 주사 시 귀에 혈관이 들어가지 않도록 주의하십시오. 34 G 또는 36 G 바늘이 있는 마이크로 주사기( 재료 표 참조)가 필요합니다. 적절한 피내 주입을 보장하기 위해 바늘은 약 10-15도 각도로 약 1mm 깊이로 구멍을 뚫어야 합니다.
4. 25일째에 1.1단계에서 설명한 대로 귀의 두께를 측정하고 기록합니다.
   참고: OA 그룹은 1.2단계에서 설명한 대로 올레산으로만 도포하고 21일부터 25일까지 식염수를 주입했습니다. C. acnes 그룹은 단계 1.3에서 기술된 바와 같이 C. acnes 현탁액에 의해서만 피내로 주사하였다. OA+ C. 여드름 기는 단계 1.2 및 1.3에 기술된 바와 같이 올레산 및 C. 여드름 현탁액으로 처리하였다.

2. 조직 채취 및 분석

1. 26일째 되는 날, 기관에서 승인된 방법을 사용하여 쥐를 인도적으로 안락사시킨 후 8mm 링 드릴로 양쪽 귀에 고정 크기로 뚫습니다.
2. 귀 조직을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담근 다음 파라핀을 내장하고 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 위해 5μm 두께의 조각으로 절단합니다²⁰. 광학 현미경으로 단면을 관찰하고 병리학자의 후속 평가를 위해 병리학적 변화를 기록합니다. 표 1 에 따라 병리학적 변화에 점수를 할당합니다( 그림 1 참조).
3. 항원 회수를 위해 섹션을 탈파라핀화, 재수화 및 가열합니다. 실온에서 15분 동안 0.3%_H2O2메탄올로 배양하여 내인성 과산화효소를 비활성화합니다.
4. 인산염 완충 식염수(PBS)로 절편을 세척한 다음 실온에서 30분 동안 3% BSA로 배양합니다.
5. TNF-α 단클론 항체 (dilution 1:800) ( 재료 표 참조)로 절편을 4 °C에서 밤새 배양합니다.
6. PBS로 절편을 다시 세척하고 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체( 재료 표 참조)로 50분 동안 배양합니다.
7. 또 다른 PBS 세척 후 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 혼합물을 슬라이드에 적용하고 현미경으로 염색 과정을 모니터링하여 원하는 강도에 도달하면 PBS와의 반응을 중지합니다.
8. Meyer의 헤마톡실린으로 절편을 1분 동안 대조염색하고 흐르는 물로 헹구고 절편을 탈수하고 장착합니다. 현미경으로 단면을 관찰하고 병리학자의 후속 평가를 위해 병리학적 변화를 기록합니다.

3. 통계 분석

1. 통계 분석을 수행합니다.
2. 데이터를 평균 ± 표준 편차로 표시합니다. Shapro-Wilke 검정을 사용하여 모든 데이터의 정규성에 액세스합니다. 정규 분포를 따르는 경우 일원 분산 분석을 사용하여 유의한 차이를 평가하십시오. 정규 분포를 따르지 않는 데이터의 경우, Kruskal-Wallis 검정을 적용한 다음 Dunn의 다중 비교를 적용합니다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

결과

두께와 피부 외관
7일째부터 21일째까지 OA 그룹과 OA + C. 여드름 그룹의 귀는 NC 및 C. 여드름 그룹의 귀보다 유의하게 두꺼웠습니다. 25일째 되는 날, OA 그룹, C. 여드름 그룹, OA + C. 여드름 그룹의 귀는 NC 그룹의 귀보다 유의하게 두꺼웠다(p < 0.05). 실험 중 귀의 평균 두께는 그림 2 및 표 2에 ?...

토론

여드름 모델에 대한 방법론과 평가 기준이 명확하지 않았기 때문에 이 프로토콜은 여드름을 연구하는 연구자들에게 참고 자료를 제공하는 것을 목표로 했습니다. 쥐 귀의 크기가 작고 등에 자라는 털로 인한 간섭으로 인해 제모 크림 및 면도기를 사용하기 때문에 쥐의 귀는 설치류 여드름 모델을 확립하는 데 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 우리는 쥐의 뒷 피부에 여드?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg