מודל חולדה של אקנה מורכב

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לגרימת דלקת אקנה בעור חולדה עם חומצה אולאית ואקנה Cutibacterium.

Abstract

אקנה וולגריס היא מחלת עור כרונית נפוצה המאופיינת בנוכחות של קומדונים, פפולות ופוסטולות על הפנים, הצוואר והחזה. כדי לדמות דלקת של אקנה וולגריס, פרוטוקול זה מפרט גישה לביסוס מודל מכרסם אקנה מורכב על ידי גרימת דלקת אקנה באוזני חולדה באמצעות חומצה אולאית ואקנה Cutibacterium (C. acnes). חולדות חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת הביקורת הרגילה (NC), אוזניים שטופלו בקבוצת חומצה אולאית (OA), אוזניים שטופלו בקבוצת C. acnes (C. acnes), אוזניים שטופלו בחומצה אולאית ו-C. acnes (OA + C. acnes). כדי לחקות ייצור חלב מוגזם, חומצה אולאית נמרחה על אוזניהן של חולדות בקבוצות OA ו- OA + C. acnes במשך 25 יום.

מימים 21 עד 25, תרחיף C. acnes הוזרק תוך עורית לאוזניים של חולדות בקבוצות C. acnes ו- OA + C. acnes כדי להחמיר את דלקת האקנה. עובי האוזן נמדד מדי שבוע כמדד לחומרת הדלקת. נערכו תצפיות גסות, צביעת המטוקסילין ואוזין ואימונוהיסטוכימיה (IHC) והתוצאות הראו כי האוזניים של קבוצת OA וקבוצת OA + C. acnes היו מעובות ומושרות, מלווה באריתמה ובנוכחות של קומדונים. בנוסף, נצפו פפולות בקבוצות C. acnes ו-OA + C. acnes . ההיסטופתולוגיה הציגה היפרקרטיניזציה והרחיבה אינפונדיבולום של זקיקי השיער בקבוצות OA ו- OA + C. acnes . חדירת תאי דלקת ומורסות נמצאו בדרמיס של קבוצות C. acnes ו- OA + C. acnes . תוצאות IHC אישרו רמות מוגברות של גורם נמק הגידול (TNF)-α בדרמיס של קבוצות C. acnes ו- OA + C. acnes . כל התוצאות הנ"ל הצביעו יחד על הקמתו המוצלחת של מודל מכרסם האקנה המורכב.

Introduction

אקנה וולגריס היא מחלת עור כרונית נפוצה המאופיינת בנוכחות קומדונים, פפולות ופוסטולות על הפנים, הצוואר והחזה, אשר, במקרים חמורים, עלולה להתקדם לגושים, ציסטות וצלקות קבועות¹. מחקרים אפידמיולוגיים מדווחים כי אקנה משפיע על 9.4% מאוכלוסיית העולם בעוד הסימפטומים הנובעים ממנו מציבים אתגרים פיזיים ופסיכו-סוציאליים חמורים ^2,3.

הפתוגנזה של אקנה היא רב-גורמית, כולל ארבעה תהליכים קריטיים: ייצור עודף חלב, היווצרות קומדון, התיישבות זקיקים על ידי מיקרוביוטה של העור, ושחרור מתווכי דלקת סביב היחידה pilosebaceous ^4,5. הפרשת חלב מוגברת, וכתוצאה מכך הצטברות של עודף חומצות שומן חופשיות בלתי רוויות (UFFAs), תורמת לרבייה חריגה של מיקרוביוטה של העור, שאחד מהם הוא Cutibacterium acnes, כפי שמוצג במחקרים גנומיים⁶. בינתיים, המיקרוביוטה של העור מפרקת את החלב ומעלה את ריכוז ה-UFFAs, מה שמוביל למעגל קסמים⁷. בנוסף, עודף UFFAs לגרום hyperkeratinization זקיקי שיער, אשר בתורו מעורר אקנה⁸. מיקרוביוטה של העור וחלב מוגבר מפעילים קולטנים דמויי אגרה (TLR) כדי לייצר ציטוקינים מעודדי דלקת מרובים כגון אינטרלוקין (IL)-1 ו-TNF-α ^9,10. מפל זה של דלקת, יחד עם חלב מוגבר וצמיחת יתר מיקרוביאלית, מגיע לשיאו היפרקרטוזיס בולט של זקיק השערה ואת הופעת אקנה¹¹.

ההתפתחות המהירה בתחום חקר האקנה והדרישות הקליניות הנלוות הניעו את יצירתם של מודלים בעלי חיים של דלקת אקנה באוזן החולדה, בגבן של חולדות או עכברים ובאוזן ארנבת 12,13,14,15. השיטות כוללות הזרקה תוך עורית של C. Acnes, יישום של שמנים על העור כדי לדמות את ההפרשה חריגה של בלוטות החלב hyperkeratinization, או שילוב של שניהם כדי להאיץ את דלקת העור כדי ליצור אקנה 16,17,18,19. עם זאת, השימוש והמינון של חומרים כימיים וחומרים ביולוגיים משתנים בין מחקרים קודמים, מה שעלול לבלבל חוקרים המתכוונים לבסס מודל אקנה מתאים. מחקר זה נועד לבסס שיטה קלה לתפעול ויעילה ליצירת מודל מכרסם אקנה מורכב ולספק סימוכין מודל לחוקרים החוקרים אקנה וולגריס.

Protocol

פרוטוקול זה קיבל אישור אתי מאוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (מס '2023033103-1183). שנים עשר חולדות ספראג-דולי זכרים (משקל, 208 גרם ± 5 גרם) שימשו בפרוטוקול זה וחולקו לארבע קבוצות: קבוצת NC (n = 3), קבוצת OA (n = 3), קבוצת C. acnes (n = 3) וקבוצת OA + C. acnes (n = 3).

1. פיתוח מודל האקנה

1. מדדו ותיעדו את עובי אוזני החולדה באמצעות קליפר ורנייר אלקטרוני (ראו טבלת חומרים) לפני המידול.
   1. הניחו את הלסת החיצונית של קליפר ורנייר האלקטרוני בנקודת האמצע של הקצה החיצוני של האוזן והרחיבו אותה לתוך תעלת האוזן. רשום את העובי של 2/3 נקודות ואת העובי של 1/2 נקודות לאורך הקו. למדוד כל נקודה 3x ולחשב את הערכים הממוצעים של עובי של שתי נקודות כדי להיחשב עובי האוזן.
2. הטו את ראש החולדה לצד אחד, הפכו את פני האוזן כלפי מעלה, ומרחו 50 מיקרוליטר חומצה אולאית (ראו טבלת חומרים) על הצד הגחוני והגבי של האוזן באופן שווה, פעם ביום, למשך 25 יום.
3. מהיום ה-21 עד היום ה-25, מדי יום לפני השימוש בחומצה אולאית, מרדימים את החולדות באמצעות איזופלורן 4% ולאחר מכן מזריקים 50 מיקרוליטר של 1 × 10⁷ CFU C. תרחיף אקנה (ראה טבלת חומרים) תוך עורית לתוך פני השטח הגחונים של האוזן באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד במחט 34 G או 36 G (ראה טבלת חומרים).
   הערה: יש להקפיד להימנע מכלי דם באוזן בעת הזרקה תוך-עורית. מיקרו-מזרק עם מחט 34 גרם או 36 גרם (ראה טבלת חומרים) נדרש. כדי להבטיח הזרקה intradermal תקין, המחט צריך להיות מנוקב בזווית של 10 עד 15 מעלות, עם עומק של כ 1 מ"מ.
4. ביום ה-25, מדדו ורשמו את עובי האוזניים, כמתואר בשלב 1.1.
   הערה: קבוצת OA נמרחה רק על ידי חומצה אולאית כמתואר בשלב 1.2 והוזרקה במי מלח מהיום ה-21 עד היום ה-25. קבוצת C. acnes הוזרק רק תוך עורית רק על ידי תרחיף C. acnes , כמתואר בשלב 1.3. קבוצת OA + C. acnes טופלה בחומצה אולאית ותרחיף C. acnes , כמתואר בשלבים 1.2 ו-1.3.

2. איסוף רקמות וניתוח

1. ביום ה-26, לאחר שהחולדות עוברות המתת חסד הומנית בשיטה שאושרה על ידי הממסד, קודחים גודל קבוע על אוזניים דו-צדדיות עם מקדח טבעתי בקוטר 8 מ"מ.
2. יש לטבול את רקמות האוזן בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות, ולאחר מכן להטמיע פרפין ולחתוך לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר להמטוקסילין ולצביעת אאוזין (HE)²⁰. התבונן בקטעים תחת מיקרוסקופ אור ורשום את השינויים הפתולוגיים להערכת מעקב על ידי פתולוג. הקצו ציונים לשינויים הפתולוגיים לפי לוח 1 (ראו גם איור 1).
3. לנטרל, להחזיר נוזלים ולחמם את החלקים לשליפת אנטיגן. יש להשבית פרוקסידאזות אנדוגניות על ידי דגירה עם 0.3% H₂O₂ במתנול למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. שטפו את החלקים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ולאחר מכן דגרו עליהם עם 3% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. יש לדגור על המקטעים עם נוגדן חד-שבטי TNF-α (דילול 1:800) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
6. שטפו שוב את המקטעים עם PBS ודגרו עם נוגדן משני מצומד פרוקסידז חזרת (ראו טבלת חומרים) למשך 50 דקות.
7. לאחר שטיפה נוספת של PBS, יש למרוח תערובת 3,3'-diaminobenzidine (DAB) על השקופיות ולנטר את תהליך הצביעה תחת מיקרוסקופ, ולעצור את התגובה עם PBS כאשר מגיעים לעוצמה הרצויה.
8. מכתימים את המקטעים בהמטוקסילין של מאייר למשך דקה, שוטפים אותם במים זורמים, מייבשים ומרכיבים את המקטעים. התבונן בסעיפים תחת מיקרוסקופ ורשום את השינויים הפתולוגיים להערכת מעקב על ידי פתולוג.

3. ניתוח סטטיסטי

1. לבצע ניתוח סטטיסטי.
2. הצגת נתונים כממוצע ± סטיית תקן. גישה לנורמליות של כל הנתונים באמצעות מבחן Shapro-Wilke. אם הוא עוקב אחר התפלגות נורמלית, השתמש ב- ANOVA חד-כיווני כדי להעריך הבדלים משמעותיים. עבור נתונים שאינם מופצים בדרך כלל, החל את מבחן Kruskal-Wallis ואחריו השוואות מרובות של דאן. ערך p קטן מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

עובי ומראה העור
מהיום השביעי ועד היום ה-21, האוזניים בקבוצת OA ובקבוצת OA + C. acnes היו עבות משמעותית מאלו של קבוצות NC ו-C. acnes . ביום ה-25, האוזניים בקבוצת OA, בקבוצת C. acnes ובקבוצת OA + C. acnes היו עבות משמעותית מאלה של קבוצת NC (p < 0.05). העובי הממוצע של האוז?...

Discussion

מכיוון שהמתודולוגיה והקריטריונים להערכה של מודל אקנה לא היו ברורים, פרוטוקול זה נועד לספק התייחסות לחוקרים החוקרים אקנה. בשל גודלה הקטן של אוזן העכבר וההפרעה הנגרמת על ידי צמיחת שיער על הגב, השימוש בקרם אפילציה ומכונת גילוח, האוזן של החולדה עשויה להיות חלופה טובה יותר ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg