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Resumen

Este protocolo describe una técnica de inmunofluorescencia multicolor para evaluar el modelo de rinitis alérgica en ratas.

Resumen

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal, mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica, que afecta aproximadamente al 10%-20% de la población mundial. Si bien la tinción por inmunofluorescencia (FI) ha sido durante mucho tiempo una técnica estándar para detectar la expresión de proteínas específicas de la enfermedad, las técnicas convencionales de FI tienen una capacidad limitada para detectar los niveles de expresión de tres o más proteínas en la misma muestra. En consecuencia, en los últimos años se han desarrollado técnicas de FI multicolor, que permiten el marcaje simultáneo de múltiples dianas en células o tejidos.

Este protocolo proporciona una visión general completa del proceso para establecer un modelo de RA en ratas, obtener muestras de mucosa nasal y los procedimientos técnicos para la inmunofluorescencia multicolor. Todas las ratas en el grupo de RA exhibieron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal, con observaciones de comportamiento que obtuvieron ≥5 puntos. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló un aumento de los recuentos de células inflamatorias y una alteración de la integridad de la mucosa nasal en el grupo AR. La inmunofluorescencia multicolor (mIF) demostró un aumento de la expresión de RORγt y TICAM-1, mientras que la expresión de Foxp3 disminuyó en el tejido de la mucosa nasal de ratas AR.

Introducción

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica1,2. Se caracteriza por síntomas como estornudos, secreción nasal, congestión nasal y picazón nasal. Con la industrialización y la urbanización, la prevalencia de la RA está aumentando gradualmente, afectando aproximadamente al 10%-20% de la población mundial1. La técnica de inmunofluorescencia (IF) es un método de tinción fluorescente que utiliza una reacción de unión anticuerpo-antígeno. Se puede emplear para detectar y cuantificar los niveles de distribución y expresión de proteínas específicas en tejidos biológicos o células. En la investigación de RA, la FI puede detectar simultáneamente múltiples dianas, incluidas citoquinas relacionadas con la RA, células inflamatorias, receptores y más, lo que facilita la exploración de la patogénesis de la RA y los efectos de los fármacos 3,4,5,6.

El proceso de tinción por inmunofluorescencia multicolor (mIF) se parece mucho al FI tradicional, con la adición de un paso de elución de anticuerpos durante cada ronda de tinción. Esta modificación permite la detección simultánea de múltiples biomarcadores en la misma sección de tejido a través de un solo etiquetado secuencial y múltiples rondas de retinción. La mIF se basa en la amplificación de la señal de tiramida (TSA), lo que permite ciclos repetidos de tinción fluorescente de TSA y el uso de calentamiento por microondas para eliminar los anticuerpos mientras se conservan las señales fluorescentes 7,8. En comparación con el FI convencional, el FIm ofrece varias ventajas: (1) puede detectar antígenos débilmente expresados que son difíciles de identificar con el FI convencional 9,10; (2) proporciona una tinción de alta calidad con una relación señal-ruido mejorada; (3) permite cuantificar las estructuras específicas de los tejidos y las regiones de interés11; (4) la multiplexación de múltiples vías utiliza eficientemente los tejidos y conserva los recursos patológicos limitados12; (5) el análisis multiparamétrico a través de mIF ofrece una visión más profunda de los tejidos, descubriendo información biológica oculta13.

En general, mIF permite la observación de diferentes expresiones y distribuciones de antígenos dentro de una misma muestra, facilitando el estudio de las proteínas diana. En el futuro, los investigadores que busquen comprender la expresión y distribución de múltiples proteínas diana encontrarán en esta técnica una opción valiosa. Este estudio demuestra la aplicación de mIF para la tinción de muestras de mucosa nasal de ratas con RA y evalúa el establecimiento de un modelo de RA en ratas.

Protocolo

El protocolo y los procedimientos experimentales han recibido la aprobación del Comité Administrativo y de Investigación Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Se obtuvieron comercialmente ratas macho Sprague Dawley (SD) de ocho semanas de edad, con un peso de 180-200 g (ver Tabla de Materiales) y se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad natural con temperatura controlada (23 ± 2 °C) y humedad relativa (55% ± 10%). Doce ratas fueron divididas aleatoriamente en dos grupos: el grupo de control y el grupo de AR. Todas las ratas se aclimataron a estas condiciones y se les proporcionó acceso gratuito a comida y agua durante una semana antes del ensayo.

1. Establecimiento de un modelo de RA en ratas

  1. Preparación de la solución sensibilizante: suspender 30 mg de ovoalbúmina (OVA) y 3 g de Al(OH)3 en 100 mL de suero fisiológico (ver Tabla de Materiales)14,15.
  2. Sensibilización básica: agarrar y sostener a la rata completamente despierta con el abdomen hacia arriba. Desinfecte el abdomen con bolas de algodón empapadas en alcohol al 75%. Utilice una jeringa de 1,5 ml para inyectar 1 ml de la solución sensibilizante preparada en el paso 1.1 en la cavidad abdominal izquierda de las ratas del grupo AR. Repita esta inyección una vez cada dos días durante 14 días (Figura 1A).
    NOTA: Asegúrese de que la cabeza de la rata esté colocada más abajo que su cola para evitar daños en los intestinos grueso y delgado al insertar la jeringa. El lugar de la inyección se encuentra a 1,5 cm de la línea media ventral. Las ratas del grupo control deben recibir inyecciones intraperitoneales de 1 ml de solución salina normal una vez cada dos días durante 14 días.
  3. Provocación nasal: Administrar 50 μL de OVA al 5% mediante gotas nasales utilizando una pipeta de 100 μL (Figura 1B) al día siguiente de la sensibilización basal, repitiendo este procedimiento durante 7 días (Figura 1C).
    NOTA: Prepare la solución de OVA al 5% mezclando 5 g de OVA con 100 ml de solución salina. Para el grupo control, administrar gotas del mismo volumen de solución salina.

2. Puntuación conductual de ratas

  1. Dentro de los 30 minutos posteriores a completar el desafío nasal final, observe y registre a las ratas con una cámara digital para identificar síntomas como rascarse la nariz, estornudar y secreción nasal, según los criterios de puntuación descritos en la Tabla 1 (Figura 1D).
    NOTA: La confirmación del modelado de RA exitoso se basa en lograr una puntuación total de ≥5 puntos14.

3. Adquisición de muestras de mucosa nasal

  1. Sacrificio de ratas: sacrificar las ratas exponiéndolas a una sobredosis de CO2. Después, desinfecte las ratas con etanol al 75% (ver Tabla de Materiales). Use un bisturí para hacer una incisión a lo largo de las dos esquinas de la boca para exponer el tejido muscular (Figura 2A). A continuación, corte las articulaciones del hueso cigomático y la mandíbula a ambos lados del cráneo con unas tijeras de tejido (Figura 2B) y retire la mandíbula (Figura 2C).
  2. Exposición de la cavidad nasal: separar la piel del maxilar con un hemostático (Figura 2D) para exponer la cavidad nasal (Figura 2E). Corte la conexión ósea entre la cavidad nasal y el maxilar con unas tijeras de tejido (Figura 2F). A continuación, cortar la conexión entre la cavidad nasal y los huesos orbitarios de ambos lados en el agujero infraorbitario (Figura 2G) y extirpar la cavidad nasal (Figura 2H).
  3. Fijación: colocar la cavidad nasal extraída en paraformaldehído al 4% para su fijación y conservarla a temperatura ambiente durante 24-72 h (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Asegúrese de que la cantidad de fijador de paraformaldehído utilizada sea suficiente para cubrir completamente las secciones para una fijación adecuada.

4. Preprocesamiento de muestras de mucosa nasal

  1. Descalcificación: comience fijando los tejidos eliminados del paso 3.1. Lávelos tres veces con PBS durante 20 minutos cada uno. A continuación, lávelos tres veces con agua destilada, cada vez durante 20 minutos. Posteriormente, descalcificar los tejidos en una solución de descalcificación con un volumen de 20-30 veces el de los tejidos a temperatura ambiente.
    1. La solución de descalcificación (ver Tabla de Materiales) debe mantener un pH de 7.2-7.4. Finalmente, coloque el tejido descalcificado en una caja de deshidratación.
      NOTA: La solución descalcificante debe cambiarse semanalmente. El proceso de descalcificación puede concluir cuando el tejido se ablanda (aproximadamente 2 meses).
  2. Deshidratación y encerado: transfiera la caja de deshidratación a un deshidratador (ver Tabla de Materiales). Comience con 75% de alcohol durante 4 h, seguido de 85% de alcohol durante 2 h, 90% de alcohol durante 2 h y 95% de alcohol durante 1 h.
    1. Posteriormente, sumerja el tejido en etanol anhidro durante 30 minutos, repita el proceso durante otros 30 minutos, use xileno durante 5-10 minutos, repita este paso durante otros 5-10 minutos, sumerja el tejido en cera durante 1 h, repita este paso durante otra hora y, finalmente, sumerja el tejido en cera durante 1 hora adicional.
  3. Incrustación: coloque el bloque de cera derretida en la caja de incrustación (consulte la tabla de materiales) y guárdelo en un congelador a -20 ° C. Una vez que la cera se solidifique, retírala y recorta el bloque de cera.
  4. Loncheado: insertar el bloque de cera recortado en un micrótomo de parafina (ver Tabla de materiales) y cortarlo en rodajas con un grosor de 3 μm. Coloque las rodajas en un baño de agua a 40 °C en un esparcidor deslizante. Aplanar el pañuelo, luego levantarlo con un portaobjetos de vidrio y hornearlo en un horno a 60 ° C.
    1. Una vez que el agua se haya evaporado y la cera esté bien fraguada, retire los portaobjetos y guárdelos a una temperatura de 25 °C.

5. Tinción de H&E del tejido de la mucosa nasal

  1. Desparafinado e hidratación: colocar las rodajas en xileno durante 20 min, repetir el proceso durante otros 20 min, etanol absoluto durante 5 min, repetir este paso durante otros 5 min, alcohol al 75% durante 5 min, y finalmente, lavar durante 5 min.
  2. Tinción con hematoxilina: dispensar 100 μL de solución de tinción con hematoxilina (ver Tabla de materiales) durante 3-5 min con una pipeta de 100 μL, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de etanol de ácido clorhídrico al 0,5% durante 10-30 s, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de agua amoniacal al 0,2% durante 10-30 s y enjuagar durante 30 s.
    NOTA: Después de la tinción con hematoxilina, es necesaria la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5% para eliminar el exceso de colorante de hematoxilina unido al núcleo y absorbido por el citoplasma. Cuando se realiza la tinción con eosina, los núcleos y el citoplasma se tiñen claramente. Las rodajas aparecerán rojas o rosadas después de la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5%, así que enjuague inmediatamente después de la diferenciación para eliminar el ácido de las rodajas de tejido y detener la diferenciación. A continuación, utilice agua con amoníaco al 0,2% para mejorar la tinción nuclear.
  3. Tinción con eosina: utilice una pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solución de tinción con eosina (consulte la Tabla de materiales) durante 5 min y enjuague durante 30 s.
  4. Deshidratación y sellado: sumergir las rodajas en etanol absoluto durante 5 minutos, repetir el proceso durante otros 5 minutos, repetir una vez más durante 5 minutos, dimetil durante 5 minutos y xileno durante 5 minutos. Por último, sellar con resina neutra (ver Tabla de Materiales).
  5. Colocación de la sección teñida en el microscopio: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible, ajuste el aumento a 40x y capture la imagen.

6. Inmunotinción multicolor del tejido de la mucosa nasal

  1. Desparafinado e hidratación: siga lo mismo que se mencionó en el paso 5.1.
  2. Tratamiento con tampón de citrato-fosfato: coloque el tampón de citrato-fosfato (pH 6,0) (consulte la tabla de materiales) en un recipiente apto para microondas. Caliéntalo hasta que hierva, retíralo y luego agrega los portaobjetos al recipiente. Cocine en el microondas a fuego medio durante 8 minutos hasta que hierva, apague el fuego durante 8 minutos y luego cambie a fuego medio-bajo durante 7 minutos.
    1. Después del enfriamiento natural, transfiera las rodajas a PBS (pH 7.4), agítelas y lávelas tres veces con una coctelera decolorante, cada vez durante 5 minutos.
      NOTA: Asegúrese de que el tampón no se evapore durante este proceso y evite que las rodajas se sequen.
  3. Bloqueo de la peroxidasa endógena: secar las rodajas, dibujar un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo inmunohistoquímico (para evitar que el anticuerpo se desvanezca) y aplicar una solución de peróxido de hidrógeno al 3% (peróxido de hidrógeno: agua pura = 1:9).
    1. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Después del enfriamiento natural, coloque las rodajas en PBS (pH 7.4) y agítelas en una coctelera decolorante durante tres ciclos de 5 minutos cada uno.
  4. Bloqueo: aplicar un 5% de suero de cabra dentro del círculo e incubar durante 30 min.
  5. Adición primaria de anticuerpos: retire suavemente la solución de bloqueo, agregue FOXP3 (dilución: 1:200, consulte la tabla de materiales) a la rebanada y colóquela en una cámara húmeda. Incubar a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Agregue una pequeña cantidad de agua a la cámara húmeda para evitar la evaporación de anticuerpos.
  6. Adición secundaria de anticuerpos: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Seque suavemente las rodajas y aplique el anticuerpo secundario (IgG H&L contra el conejo de cabra, consulte la tabla de materiales) dentro del círculo. Incubar a temperatura ambiente durante 50 minutos en la oscuridad.
  7. Preparación de la solución de dilución de tiramida: combinar 100 μL de H 2 O2al 3% con 100 ml de 1x TBST (ver Tabla de Materiales).
  8. Adición de la solución de trabajo TSA: Mezcle 1 ml de diluyente de tiramida con 2 μl de CY3-tiramida para preparar la solución de trabajo de TSA. Aplicar 100 μL de solución de trabajo TSA a cada rebanada e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. Luego, lave las rodajas con PBS tres veces, 5 minutos cada vez.
    NOTA: Prepare y utilice inmediatamente la solución de trabajo TSA y guárdela a 4 °C en la oscuridad; Tiene una validez de hasta 24 h.
  9. Repita los pasos 6.2-6.8: cambie a una dilución 1:200 de RORγt (colorante fluorescente FITC) y luego a una dilución 1:200 de TICAM1 (colorante TYP620) (consulte la Tabla de materiales).
  10. Núcleos contrateñidos con DAPI: agitar suavemente las rodajas para secarlas, aplicar solución de tinción DAPI e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
  11. Autofluorescencia de apagado: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Aplique el extintor de autofluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a las rodajas, espere 5 minutos y luego lave durante 10 minutos.
  12. Bloqueo: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Agite suavemente las rodajas para secarlas y séllelas con el extintor antifluorescente (consulte la tabla de materiales).
  13. Microscopía: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para una visibilidad clara, ajuste el aumento a 20x y 40x y capture la imagen.
    NOTA: DAPI tiene una longitud de onda de excitación UV de 330-380 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm (luz azul). FITC tiene una longitud de onda de excitación de 465-495 nm y una longitud de onda de emisión de 515-555 nm (luz verde). CY3 tiene una longitud de onda de excitación de 510-560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm (luz roja). TYP-690 tiene una longitud de onda de excitación de 630 nm y una longitud de onda de emisión de 690 nm (luz rosa).

Resultados

Seis ratas SD fueron inducidas con éxito en el modelo AR mediante inyección intraperitoneal de OVA y provocación nasal. La RA fue inducida en todas las ratas del grupo AR, lo que representa el 100% del grupo. Todas las ratas del grupo AR mostraron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal. Todas las observaciones conductuales obtuvieron una puntuación de ≥5 puntos (Tabla 2).

Los resultados de la tinción de H&E enel día 21 del mode...

Discusión

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria no infecciosa de la mucosa nasal que resulta de una combinación de factores ambientales y genéticos. Se ha convertido en un problema de salud mundial, que afecta la eficiencia del trabajo, disminuye la calidad de vida, perjudica el sueño, la función cognitiva y causa irritabilidad y fatiga. La RA afecta a entre el 10 % y el 20 % de la población mundial¹ y conlleva costes económicos sustanciales, causando pérdidas anuales de hasta 30-50 mil millones de euros...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2021YJ0175).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% ethanolAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmmoniaChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anhydrous ethanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Anti-fluorescence quenching sealerSouthernBiotech0100-01
Automatic dyeing machineThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier slidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Citrate-phosphate buffer Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
CoverslipNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
CoverslipNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Decoloring shakerSCILOGEXS1010E
EDTA decalcification solutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Electric heating blast dryer Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fast tissue dewatering machineThermo scientificSTP420 ES
Film sealerThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Fluorescence microscopeSunny Optical Technology Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Freezing tableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Goat serumBiosharpBL210A
H&E staining kitLeageneDH0020
Hemostatic forcepsShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Hydrochloric acidSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Immunohistochemical penBiosharpBC004
Microwave ovenMideaM1-L213B
Neutral gumSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Palm centrifugeSCILOGEXD1008E
ParaformaldehydeBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Pathology section scanner3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS bufferBiosharpG4202
Pipette DragonKE0003087/KA0056573
RorγtAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
SlicerThermo scientificHM325
Slicing machineThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley ratsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-4465 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Tissue scissorsShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Tissue spreading baking sheet machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 fluorescent dyesShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Vortex mixerSCILOGEXSLK-O3000-S
Water bath-slide drierWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Wax trimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

Referencias

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