Marquage immunofluorescent dans des coupes de tissu de muqueuse nasale de rats atteints de rhinite allergique par immunodosage multicolore

Résumé

Ce protocole décrit une technique d’immunofluorescence multicolore pour évaluer le modèle de rhinite allergique chez le rat.

Résumé

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique et non infectieuse de la muqueuse nasale, principalement médiée par des immunoglobulines E (IgE) spécifiques, qui touche environ 10 à 20 % de la population mondiale. Alors que la coloration par immunofluorescence (FI) est depuis longtemps une technique standard pour détecter l’expression de protéines spécifiques à une maladie, les techniques IF conventionnelles sont limitées dans leur capacité à détecter les niveaux d’expression de trois protéines ou plus dans le même échantillon. Par conséquent, des techniques d’IF multicolores ont été développées ces dernières années, qui permettent le marquage simultané de plusieurs cibles dans des cellules ou des tissus.

Ce protocole fournit une vue d’ensemble complète du processus d’établissement d’un modèle d’AR chez le rat, d’obtention d’échantillons de muqueuse nasale et des procédures techniques d’immunofluorescence multicolore. Tous les rats du groupe AR présentaient des symptômes typiques tels que des éternuements, un écoulement nasal et des démangeaisons nasales, les observations comportementales obtenant un score de ≥5 points. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a révélé une augmentation du nombre de cellules inflammatoires et une perturbation de l’intégrité de la muqueuse nasale dans le groupe AR. L’immunofluorescence multicolore (mIF) a démontré une augmentation de l’expression de RORγt et de TICAM-1, tandis que l’expression de Foxp3 a diminué dans le tissu de la muqueuse nasale des rats AR.

Introduction

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique et non infectieuse de la muqueuse nasale principalement médiée par des immunoglobulines E (IgE) ^{spécifiques1,2}. Elle se caractérise par des symptômes tels que des éternuements, un écoulement nasal, une congestion nasale et des démangeaisons nasales. Avec l’industrialisation et l’urbanisation, la prévalence de la RA augmente progressivement, affectant environ 10 à 20 % de la population mondiale¹. La technique d’immunofluorescence (IF) est une méthode de coloration fluorescente qui utilise une réaction de liaison anticorps-antigène. Il peut être utilisé pour détecter et quantifier les niveaux de distribution et d’expression de protéines spécifiques dans les tissus biologiques ou les cellules. Dans la recherche sur la RA, l’IF peut détecter simultanément plusieurs cibles, y compris les cytokines liées à la RA, les cellules inflammatoires, les récepteurs, etc., ce qui facilite l’exploration de la pathogenèse de la RA et des effets des médicaments 3,4,5,6.

Le processus de coloration par immunofluorescence multicolore (mIF) ressemble beaucoup à l’IF traditionnel, avec l’ajout d’une étape d’élution d’anticorps lors de chaque cycle de coloration. Cette modification permet la détection simultanée de plusieurs biomarqueurs sur la même coupe de tissu grâce à un marquage unique séquentiel et à plusieurs cycles de recoloration. mIF est basé sur l’amplification du signal tyramide (TSA), ce qui permet des cycles répétés de coloration fluorescente TSA et l’utilisation du chauffage par micro-ondes pour éliminer les anticorps tout en conservant les signaux fluorescents ^7,8. Par rapport à l’IF conventionnelle, la FIm offre plusieurs avantages : (1) elle peut détecter des antigènes faiblement exprimés qui sont difficiles à identifier avec l’IF ^9,10 conventionnelle ; (2) il fournit une coloration de haute qualité avec un rapport signal/bruit amélioré ; (3) il permet de quantifier les structures tissulaires spécifiques et les régions d’intérêt¹¹ ; (4) le multiplexage de plusieurs voies utilise efficacement les tissus et préserve les ressources pathologiques limitées¹² ; (5) L’analyse multiparamétrique par mIF offre des informations plus approfondies sur les tissus, découvrant des informations biologiques cachées¹³.

Dans l’ensemble, mIF permet d’observer différentes expressions et distributions d’antigènes au sein d’un même échantillon, facilitant ainsi l’étude des protéines cibles. À l’avenir, les chercheurs qui cherchent à comprendre l’expression et la distribution de plusieurs protéines cibles trouveront dans cette technique un choix précieux. Cette étude démontre l’application de la mIF pour la coloration d’échantillons de muqueuse nasale de rats avec AR et évalue l’établissement d’un modèle d’AR chez le rat.

Protocole

Le protocole et les procédures expérimentales ont reçu l’approbation du Comité administratif et de recherche animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (numéro d’enregistrement : 2022DL-010). Des rats Sprague Dawley (SD) mâles âgés de huit semaines, pesant de 180 à 200 g, ont été obtenus dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et logés dans un cycle de lumière/obscurité naturelle à température contrôlée (23 ± 2 °C) et humidité relative (55 % ± 10 %). Douze rats ont été répartis au hasard en deux groupes : le groupe témoin et le groupe AR. Tous les rats ont été acclimatés à ces conditions et ont eu un accès gratuit à la nourriture et à l’eau pendant une semaine avant l’essai.

1. Mise en place d’un modèle de RA chez le rat

1. Préparation de la solution sensibilisante : suspendre 30 mg d’ovalbumine (OVA) et 3 g d’Al(OH)₃ dans 100 mL de solution saline (voir tableau des matériaux)^14,15.
2. Sensibilisation de base : saisir et tenir le rat complètement éveillé avec son abdomen vers le haut. Désinfectez l’abdomen à l’aide de boules de coton imbibées d’alcool à 75 %. À l’aide d’une seringue de 1,5 mL, injecter 1 mL de la solution sensibilisante préparée à l’étape 1.1 dans la cavité abdominale gauche des rats du groupe AR. Répétez cette injection une fois tous les deux jours pendant 14 jours (Figure 1A).
   REMARQUE : Assurez-vous que la tête du rat est positionnée plus bas que sa queue pour éviter d’endommager le gros intestin et l’intestin grêle lors de l’insertion de la seringue. Le site d’injection est situé à 1,5 cm de la ligne médiane ventrale. Les rats du groupe témoin doivent recevoir des injections intrapéritonéales de 1 mL de solution saline normale une fois tous les deux jours pendant 14 jours.
3. Provocation nasale : Administrer 50 μL d’OVA à 5 % par gouttes nasales à l’aide d’une pipette de 100 μL (Figure 1B) le lendemain de la sensibilisation basale, en répétant cette procédure pendant 7 jours (Figure 1C).
   REMARQUE : Préparer la solution d’OVA à 5 % en mélangeant 5 g d’OVA avec 100 mL de solution saline. Pour le groupe témoin, administrez des gouttes du même volume de solution saline.

2. Évaluation comportementale des rats

1. Dans les 30 minutes suivant la fin de l’épreuve nasale finale, observez et enregistrez les rats à l’aide d’un appareil photo numérique pour identifier les symptômes tels que le grattage nasal, les éternuements et l’écoulement nasal, en fonction des critères de notation décrits dans le tableau 1 (figure 1D).
   REMARQUE : La confirmation de la réussite de la modélisation AR est basée sur l’obtention d’un score total de ≥5 points¹⁴.

3. Acquisition d’échantillons de muqueuse nasale

1. Sacrifier des rats : sacrifier les rats en les exposant à une surdose de CO₂. Ensuite, désinfectez les rats avec de l’éthanol à 75 % (voir le tableau des matériaux). À l’aide d’un scalpel, faites une incision le long des deux coins de la bouche afin d’exposer le tissu musculaire (figure 2A). Ensuite, coupez les articulations de l’os zygomatique et de la mandibule des deux côtés du crâne à l’aide de ciseaux à tissu (Figure 2B) et retirez la mandibule (Figure 2C).
2. Exposition des fosses nasales : séparer la peau du maxillaire à l’aide d’un hémostatique (Figure 2D) pour exposer la cavité nasale (Figure 2E). Coupez la connexion osseuse entre la cavité nasale et le maxillaire avec des ciseaux à tissu (Figure 2F). Ensuite, coupez la connexion entre la cavité nasale et les os orbitaires des deux côtés au niveau du foramen sous-orbitaire (Figure 2G) et retirez la cavité nasale (Figure 2H).
3. Fixation : placer la cavité nasale extraite dans du paraformaldéhyde à 4% pour la fixation et la conserver à température ambiante pendant 24-72 h (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE : Assurez-vous que la quantité de fixateur de paraformaldéhyde utilisée est suffisante pour recouvrir complètement les sections pour une fixation correcte.

4. Prétraitement des échantillons de muqueuse nasale

1. Décalcification : commencez par fixer les tissus retirés de l’étape 3.1. Lavez-les trois fois avec du PBS pendant 20 min chacun. Ensuite, lavez-les trois fois avec de l’eau distillée, chaque fois pendant 20 minutes. Ensuite, détartrez les tissus dans une solution de décalcification d’un volume de 20 à 30 fois celui des tissus à température ambiante.
   1. La solution de décalcification (voir le tableau des matériaux) doit maintenir un pH de 7,2 à 7,4. Enfin, placez le tissu détartré dans une boîte de déshydratation.
      REMARQUE : La solution de détartrage doit être changée chaque semaine. Le processus de décalcification peut être terminé lorsque le tissu se ramollit (environ 2 mois).
2. Déshydratation et épilation à la cire : transférer la boîte de déshydratation dans un déshydrateur (voir tableau des matériaux). Commencez avec 75 % d’alcool pendant 4 h, suivi de 85 % d’alcool pendant 2 h, de 90 % d’alcool pendant 2 h et de 95 % d’alcool pendant 1 h.
   1. Ensuite, plongez le tissu dans de l’éthanol anhydre pendant 30 minutes, répétez le processus pendant 30 minutes supplémentaires, utilisez du xylène pendant 5 à 10 minutes, répétez cette étape pendant encore 5 à 10 minutes, plongez le tissu dans de la cire pendant 1 h, répétez cette étape pendant une autre heure et enfin, plongez le tissu dans de la cire pendant 1 heure supplémentaire.
3. Enrobage : placez le bloc de cire fondu dans la boîte d’enrobage (voir tableau des matériaux) et conservez-le dans un congélateur à -20 °C. Une fois que la cire s’est solidifiée, retirez-la et coupez le bloc de cire.
4. Tranchage : insérez le bloc de cire paré dans un microtome de paraffine (voir tableau des matériaux) et coupez-le en tranches d’une épaisseur de 3 μm. Placez les tranches au bain-marie à 40 °C sur un épandeur à glissière. Aplatissez le mouchoir, puis soulevez-le à l’aide d’une lame de verre et faites-le cuire au four à 60 °C.
   1. Une fois que l’eau s’est évaporée et que la cire est correctement prise, retirez les lames et stockez-les à une température de 25 °C.

5. Coloration H&E du tissu muqueux nasal

1. Déparaffinage et hydratation : placez les tranches dans du xylène pendant 20 min, répétez le processus pendant encore 20 min, de l’éthanol absolu pendant 5 min, répétez cette étape pendant encore 5 min, de l’alcool à 75% pendant 5 min, et enfin, lavez pendant 5 min.
2. Coloration à l’hématoxyline : distribuer 100 μL de solution de coloration à l’hématoxyline (voir Tableau des matériaux) pendant 3 à 5 min à l’aide d’une pipette de 100 μL, rincer pendant 5 à 10 s, ajouter 100 μL d’éthanol d’acide chlorhydrique à 0,5 % pendant 10 à 30 s, rincer pendant 5 à 10 s, ajouter 100 μL d’eau ammoniacale à 0,2 % pendant 10 à 30 s et rincer pendant 30 s.
   REMARQUE : Après la coloration à l’hématoxyline, la différenciation avec de l’éthanol d’acide chlorhydrique à 0,5% est nécessaire pour éliminer l’excès de colorant hématoxyline lié au noyau et absorbé par le cytoplasme. Lorsque la coloration à l’éosine est effectuée, les noyaux et le cytoplasme seront clairement colorés. Les tranches apparaîtront rouges ou roses après la différenciation avec de l’éthanol d’acide chlorhydrique à 0,5%, alors rincez immédiatement après la différenciation pour éliminer l’acide des tranches de tissu afin d’arrêter la différenciation. Ensuite, utilisez de l’eau à 0,2 % d’ammoniac pour améliorer la coloration nucléaire.
3. Coloration à l’éosine : utiliser une pipette de 100 μL pour distribuer 100 μL de solution de coloration à l’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 5 min et rincer pendant 30 s.
4. Déshydratation et scellage : plongez les tranches dans de l’éthanol absolu pendant 5 min, répétez le processus pendant encore 5 min, répétez une fois de plus pendant 5 min, diméthyle pendant 5 min et xylène pendant 5 min. Enfin, scellez avec de la résine neutre (voir tableau des matériaux).
5. Placer la section colorée sur le microscope : positionnez la section colorée sur le microscope, ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que l’image soit clairement visible, réglez le grossissement sur 40x et capturez l’image.

6. Immunomarquage multicolore du tissu muqueux nasal

1. Déparaffinage et hydratation : suivez les mêmes que ceux mentionnés à l’étape 5.1.
2. Traitement tampon citrate-phosphate : placer le tampon citrate-phosphate (pH 6,0) (voir tableau des matériaux) dans un récipient allant au micro-ondes. Chauffez-le jusqu’à ébullition, retirez-le, puis ajoutez les lames dans le récipient. Cuire au micro-ondes à feu moyen pendant 8 min jusqu’à ébullition, éteindre le feu pendant 8 min, puis passer à feu moyen-doux pendant 7 min.
   1. Après refroidissement naturel, transférez les tranches dans du PBS (pH 7,4), secouez-les et lavez-les trois fois à l’aide d’un shaker décolorant, à chaque fois pendant 5 min.
      REMARQUE : Assurez-vous que le tampon ne s’évapore pas pendant ce processus et évitez que les tranches ne se dessèchent.
3. Blocage de la peroxydase endogène : séchez les tranches, tracez un cercle autour du tissu avec un stylo immunohistochimique (pour empêcher l’anticorps de s’écouler) et appliquez une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % (peroxyde d’hydrogène : eau pure = 1 :9).
   1. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 min. Après refroidissement naturel, placez les tranches dans du PBS (pH 7,4) et secouez-les sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun.
4. Blocage : appliquer 5% de sérum de chèvre dans le cercle et incuber pendant 30 min.
5. Ajout d’anticorps primaires : retirez délicatement la solution bloquante, ajoutez FOXP3 (dilution : 1 :200, voir tableau des matériaux) à la tranche et placez-la dans une chambre humide. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Ajoutez une petite quantité d’eau dans la chambre humide pour empêcher l’évaporation des anticorps.
6. Ajout d’anticorps secondaires : placer les tranches dans du PBS (pH 7,4) et les agiter sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun. Séchez délicatement les tranches et appliquez l’anticorps secondaire (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, voir Tableau des matériaux) à l’intérieur du cercle. Incuber à température ambiante pendant 50 min dans l’obscurité.
7. Préparation de la solution de dilution de Tyramide : mélanger 100 μL de 3% H2 O₂ avec 100 mL de 1x TBST (voir Tableau des matériaux).
8. Ajout de la solution de travail TSA : Mélanger 1 mL de diluant de Tyramide avec 2 μL de CY3-Tyramide pour préparer la solution de travail TSA. Appliquer 100 μL de solution de travail TSA sur chaque tranche et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les tranches avec du PBS trois fois, 5 min à chaque fois.
   REMARQUE : Préparez et utilisez immédiatement la solution de travail TSA et stockez-la à 4 °C dans l’obscurité ; Il est valable jusqu’à 24 h.
9. Répétez les étapes 6.2 à 6.8 : passez à une dilution de 1 :200 de RORγt (colorant fluorescent FITC), puis à une dilution de 1 :200 de TICAM1 (colorant TYP620) (voir le tableau des matériaux).
10. Noyaux contre-colorés DAPI : secouer doucement les tranches pour les sécher, appliquer la solution colorante DAPI et incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
11. Autofluorescence de trempe : placer les tranches dans du PBS (pH 7,4) et les agiter sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun. Appliquez le désaltérant d’autofluorescence (voir tableau des matériaux) sur les tranches, attendez 5 min, puis lavez pendant 10 min.
12. Blocage : placer les tranches dans du PBS (pH 7,4) et les agiter sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun. Secouez doucement les tranches pour les sécher et scellez-les avec la pastille anti-fluorescence (voir tableau des matériaux).
13. Microscopie : placez la section colorée sur le microscope, ajustez la mise au point du microscope pour une visibilité claire, réglez le grossissement sur 20x et 40x et capturez l’image.
    REMARQUE : DAPI a une longueur d’onde d’excitation UV de 330-380 nm et une longueur d’onde d’émission de 420 nm (lumière bleue). Le FITC a une longueur d’onde d’excitation de 465 à 495 nm et une longueur d’onde d’émission de 515 à 555 nm (lumière verte). CY3 a une longueur d’onde d’excitation de 510-560 nm et une longueur d’onde d’émission de 590 nm (lumière rouge). Le TYP-690 a une longueur d’onde d’excitation de 630 nm et une longueur d’onde d’émission de 690 nm (lumière rose).

Résultats

Six rats SD ont été induits avec succès dans le modèle AR par injection intrapéritonéale OVA et provocation nasale. La RA a été induite chez tous les rats du groupe AR, représentant 100% du groupe. Tous les rats du groupe AR présentaient des symptômes typiques tels que des éternuements, un écoulement nasal et des démangeaisons nasales. Toutes les observations comportementales ont obtenu un score de ≥5 points (tableau 2).

Les résultats de la coloration H&E au 2...

Discussion

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire non infectieuse de la muqueuse nasale résultant d’une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques. Il est devenu un problème de santé mondial, ayant un impact sur l’efficacité au travail, diminuant la qualité de vie, altérant le sommeil, les fonctions cognitives et provoquant de l’irritabilité et de la fatigue. La réalité augmentée touche 10 à 20 % de la population mondiale¹ et entraîne des coûts économiques considérables, causant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Al(OH)3	Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd	A7130
75% ethanol	Anhui Yiren An Co., Ltd	20210107
Ammonia	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Anhydrous ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Anti-fluorescence quenching sealer	SouthernBiotech	0100-01
Automatic dyeing machine	Thermo scientific	Varistain Gemini ES
Carrier slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Citrate-phosphate buffer	Servicebio biotechnology co., Ltd	G1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)	Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1201
Coverslip	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Coverslip	Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd	CS01-2450
CY3-Tyramide	Sawell Biotechnology Co., Ltd	G1223-50UL
DAPI	Sawell Biotechnology Co., Ltd	G1012
Decoloring shaker	SCILOGEX	S1010E
EDTA decalcification solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Electric heating blast dryer	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fast tissue dewatering machine	Thermo scientific	STP420 ES
Film sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
FITC-Tyramide	Sawell Biotechnology Co., Ltd	G1222-50UL
Fluorescence microscope	Sunny Optical Technology Co.Ltd	CX40
Foxp3	Affinity Biosciences Co., Ltd	bs-10211R
Freezing table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Liankebio Co., Ltd	GAR0072
Goat serum	Biosharp	BL210A
H&E staining kit	Leagene	DH0020
Hemostatic forceps	Shanghai Medical Devices Co., Ltd	J31010
Hydrochloric acid	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
Immunohistochemical pen	Biosharp	BC004
Microwave oven	Midea	M1-L213B
Neutral gum	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Ovalbumin	Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd	A804010
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
Palm centrifuge	SCILOGEX	D1008E
Paraformaldehyde	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0099-100ml
Pathology section scanner	3DHISTECH Kft	Pannoramic SCAN
PBS buffer	Biosharp	G4202
Pipette	Dragon	KE0003087/KA0056573
Rorγt	Affinity Biosciences Co., Ltd	DF3196
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B	Bioengineering Co., Ltd	A602008-0025
Slicer	Thermo scientific	HM325
Slicing machine	Thermo scientific	HM325
Slide	Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd	PC2-301
Sprague Dawley rats	Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine	SYX 2023-0100
TICAM-1	Affinity Biosciences Co., Ltd	DF6289
Tissue scissors	Shanghai Medical Devices Co., Ltd	J22120
Tissue spreading baking sheet machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
TYR-690 fluorescent dyes	Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd	RC0086-34RM
Vortex mixer	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Water bath-slide drier	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Wax trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901