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요약

이 프로토콜은 알레르기 비염의 쥐 모델을 평가하기 위한 다색 면역형광 기법을 설명합니다.

초록

알레르기 비염(AR)은 주로 특정 면역글로불린 E(IgE)에 의해 매개되는 코 점막의 만성 비감염성 염증성 질환으로, 전 세계 인구의 약 10%-20%에 영향을 미칩니다. 면역형광(IF) 염색은 오랫동안 질병 특이적 단백질 발현을 검출하기 위한 표준 기법이었지만, 기존의 IF 기법은 동일한 샘플에서 3개 이상의 단백질 발현 수준을 검출하는 데 한계가 있습니다. 그 결과, 최근 몇 년 동안 세포 또는 조직에서 여러 표적을 동시에 라벨링할 수 있는 다색 IF 기술이 개발되었습니다.

이 프로토콜은 AR의 쥐 모델을 확립하고, 비강 점막 샘플을 얻고, 다색 면역형광을 위한 기술 절차를 위한 프로세스에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다. AR 그룹의 모든 쥐는 재채기, 콧물, 코 가려움증과 같은 전형적인 증상을 보였으며 행동 관찰에서 ≥5점을 받았습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과 AR 그룹에서 염증 세포 수가 증가하고 코 점막 무결성이 손상되었습니다. 다색 면역형광(mIF)은 AR 쥐의 코 점막 조직에서 RORγt 및 TICAM-1의 발현이 증가한 반면 Foxp3 발현은 감소한 것으로 나타났습니다.

서문

알레르기 비염(AR)은 주로 특정 면역글로불린 E(IgE)에 의해 매개되는 코 점막의 만성 비감염성 염증성 질환입니다1,2. 재채기, 콧물, 코막힘, 코 가려움증 등의 증상이 특징입니다. 산업화와 도시화로 AR의 보급률이 점차 증가하여 세계 인구의 약 10%-20%에 영향을 미치고 있습니다1. 면역형광(IF) 기법은 항체-항원 결합 반응을 활용하는 형광 염색 방법입니다. 생물학적 조직 또는 세포에서 특정 단백질의 분포 및 발현 수준을 감지하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. AR 연구에서 IF는 AR 관련 사이토카인, 염증 세포, 수용체 등을 포함한 여러 표적을 동시에 검출할 수 있어 AR 발병 기전 및 약물의 효과 탐색을 용이하게 합니다 3,4,5,6.

다색 면역형광(mIF) 염색 공정은 기존 IF와 매우 유사하며, 각 염색 라운드마다 항체 용출 단계가 추가됩니다. 이 변형을 통해 순차적인 단일 라벨링 및 여러 차례의 재염색을 통해 동일한 조직 절편에서 여러 바이오마커를 동시에 검출할 수 있습니다. mIF는 티라미드 신호 증폭(TSA)을 기반으로 하며, 형광 신호 7,8을 유지하면서 TSA 형광 염색 및 마이크로파 가열을 사용하여 항체를 제거하는 반복적인 주기를 허용합니다. 기존의 IF와 비교하여, mIF는 다음과 같은 몇 가지 장점을 제공합니다: (1) 기존의 IF 9,10으로 식별하기 어려운 약하게 발현된 항원을 검출할 수 있습니다. (2) 향상된 신호 대 잡음비로 고품질 염색을 제공합니다. (3) 조직 특이적 구조 및 관심 영역(11)을 정량화할 수 있다. (4) 다중 경로를 다중화하여 조직을 효율적으로 활용하고 제한된 병리학적 자원을 보존한다12; (5) mIF를 통한 다중 파라미터 분석은 조직에 대한 심층적인 통찰력을 제공하여 숨겨진 생물학적 정보를 밝혀냅니다13.

전반적으로 mIF를 사용하면 동일한 샘플 내에서 다양한 항원 발현 및 분포를 관찰할 수 있어 표적 단백질 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 앞으로 여러 표적 단백질의 발현과 분포를 이해하고자 하는 연구자들은 이 기술이 가치 있는 선택이라는 것을 알게 될 것입니다. 이 연구는 AR로 쥐의 코 점막 샘플을 염색하기 위한 mIF의 적용을 보여주고 AR의 쥐 모델 확립을 평가합니다.

프로토콜

실험 프로토콜 및 절차는 청두 중국 전통 의학 대학 행정 및 동물 연구 위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2022DL-010). 무게가 180-200g인 8주 된 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐를 상업적으로 획득하여( 재료 표 참조) 온도(23 ± 2°C) 및 상대 습도(55% ± 10%)를 제어하여 자연광/어두움 주기에 보관했습니다. 12마리의 쥐를 무작위로 대조군과 AR군의 두 그룹으로 나눴다. 모든 쥐는 이러한 조건에 적응하고 실험 전 일주일 동안 음식과 물을 무료로 이용할 수 있었습니다.

1. AR의 쥐 모델 구축

  1. 감작 용액 준비: 식염수 100mL에 30mg의 오브알부민(OVA)과 3g의 Al(OH)3을 현탁시킵니다(재료 표 참조)14,15.
  2. 기본 감작: 완전히 깨어 있는 쥐의 복부가 위를 향하도록 잡고 잡습니다. 알코올에 적신 면봉 75%를 사용하여 복부를 소독합니다. 1.5mL 주사기를 사용하여 1.1단계에서 제조한 감작 용액 1mL를 AR 그룹 쥐의 좌복강에 주입합니다. 14일 동안 이틀에 한 번씩 이 주사를 반복합니다(그림 1A).
    알림: 주사기를 삽입할 때 대장과 소장의 손상을 방지하기 위해 쥐의 머리가 꼬리보다 낮게 위치하도록 하십시오. 주사 부위는 복부 정중선에서 1.5cm 떨어져 있습니다. 대조군의 쥐는 14일 동안 이틀에 한 번씩 1mL의 생리식염수를 복강 내 주사해야 합니다.
  3. 비강 챌린지: 기초 감작 다음 날 100μL 피펫(그림 1B)을 사용하여 점안액을 통해 5% OVA 50μL를 투여하고 이 절차를 7일 동안 반복합니다(그림 1C).
    참고: 5g의 OVA와 식염수 100mL를 혼합하여 5% OVA 용액을 준비합니다. 대조군의 경우 동일한 양의 식염수를 점안합니다.

2. 쥐의 행동 점수

  1. 최종 비강 챌린지를 완료한 후 30분 이내에 디지털 카메라를 사용하여 쥐를 관찰하고 기록하여 표 1 (그림 1D)에 요약된 채점 기준에 따라 코 긁기, 재채기 및 콧물과 같은 증상을 식별합니다.
    참고: AR 모델링 성공 여부는 총점 ≥5점14 달성을 기준으로 합니다.

3. 코 점막 샘플 채취

  1. 쥐 희생: 쥐를 CO2 과다 복용에 노출시켜 쥐를 희생시킵니다. 그런 다음 75 % 에탄올로 쥐를 소독하십시오 ( 재료 표 참조). 메스를 사용하여 입의 두 모서리를 따라 절개하여 근육 조직을 노출시킵니다(그림 2A). 다음으로, 조직 가위를 사용하여 두개골 양쪽의 접합골과 하악골의 관절을 자르고(그림 2B), 하악골을 제거합니다(그림 2C).
  2. 비강 노출: 지혈제(그림 2D)를 사용하여 상악의 피부를 분리하여 비강을 노출시킵니다(그림 2E). 조직 가위로 비강과 상악골 사이의 뼈 연결을 자릅니다(그림 2F). 그런 다음 안와하공(inorbital foramen)에서 양쪽의 비강과 안와골(orbital bone) 사이의 연결을 절단하고(그림 2G) 비강을 제거합니다(그림 2H).
  3. 고정: 추출된 비강을 고정을 위해 4% 파라포름알데히드에 넣고 실온에서 24-72시간 동안 보관합니다( 재료 표 참조).
    알림: 사용된 파라포름알데히드 고정제의 양이 적절한 고정을 위해 섹션을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한지 확인하십시오.

4. 비강 점막 검체의 전처리

  1. 석회질 제거: 3.1단계에서 제거된 조직을 고정하는 것으로 시작합니다. PBS로 각각 20분씩 세 번 씻습니다. 그런 다음 증류수로 매번 20분 동안 세 번 씻습니다. 그 후, 실온에서 조직의 20-30배 부피의 석회질 제거 용액에서 조직을 석회질화합니다.
    1. 석회질 제거 용액( 재료 표 참조)은 pH를 7.2-7.4로 유지해야 합니다. 마지막으로 석회질이 제거된 조직을 탈수 상자에 넣는다.
      알림: 석회질 제거 용액은 매주 교체해야 합니다. 석회질 제거 과정은 조직이 부드러워지면 종료될 수 있습니다(약 2개월).
  2. 탈수 및 왁싱: 탈수 상자를 탈수기로 옮깁니다( 재료 표 참조). 4시간 동안 75% 알코올로 시작한 다음 2시간 동안 85% 알코올, 2시간 동안 90% 알코올, 1시간 동안 95% 알코올로 시작합니다.
    1. 그 후, 조직을 무수 에탄올에 30 분 동안 담그고, 30 분 더 과정을 반복하고, 5-10 분 동안 크실렌을 사용하고,이 단계를 5-10 분 더 반복하고, 조직을 왁스에 1 시간 동안 담그고,이 단계를 한 시간 더 반복하고, 마지막으로 조직을 왁스에 1 시간 더 담그십시오.
  3. 임베딩: 녹인 왁스 블록을 임베딩 상자( 재료 표 참조)에 넣고 -20°C 냉동실에 보관합니다. 왁스가 굳으면 제거하고 왁스 블록을 다듬습니다.
  4. 슬라이싱: 트리밍된 왁스 블록을 파라핀 마이크로톰( 재료 표 참조)에 삽입하고 3μm 두께의 조각으로 자릅니다. 슬라이드 스프레더의 40°C 수조에 조각을 놓습니다. 티슈를 평평하게 펴고 유리 슬라이드로 들어 올려 60°C 오븐에서 굽습니다.
    1. 물이 증발하고 왁스가 제대로 굳은 후 슬라이드를 제거하고 25°C의 온도에서 보관하십시오.

5. 코 점막 조직의 H&E 염색

  1. 탈왁스 및 수화: 슬라이스를 크실렌에 20분 동안 넣고 20분 더 반복하고 절대 에탄올을 5분 동안 반복하고 이 단계를 5분 더 반복하고 75% 알코올을 5분 동안 반복한 다음 마지막으로 5분 동안 세척합니다.
  2. 헤마톡실린 염색: 100μL 피펫을 사용하여 100μL의 헤마톡실린 염색 용액( 재료 표 참조)을 3-5분 동안 분주하고, 5-10초 동안 헹구고, 100μL의 0.5% 염산 에탄올 10-30초 동안 추가하고, 5-10초 동안 헹구고, 0.2% 암모니아수 100μL를 10-30초 동안 추가하고, 30초 동안 헹굽니다.
    참고: 헤마톡실린 염색 후 핵에 결합되고 세포질에 흡수된 과도한 헤마톡실린 염료를 제거하기 위해 0.5% 염산 에탄올로 분화해야 합니다. 에오신 염색을 수행하면 핵과 세포질이 명확하게 염색됩니다. 조각은 0.5% 염산 에탄올로 분화 후 빨간색 또는 분홍색으로 나타나므로 분화 직후 헹구어 조직 조각에서 산을 제거하여 분화를 중단하십시오. 그런 다음 0.2% 암모니아수를 사용하여 핵 염색을 강화합니다.
  3. 에오신 염색: 100μL 피펫을 사용하여 100μL의 에오신 염색 용액( 재료 표 참조)을 5분 동안 분주하고 30초 동안 헹굽니다.
  4. 탈수 및 밀봉: 절편을 무수 에탄올에 5분 동안 담그고, 이 과정을 5분 더 반복하고, 5분 동안 한 번 더 반복하고, 디메틸을 5분 동안 반복하고, 자일렌을 5분 동안 반복합니다. 마지막으로 중성 수지로 밀봉합니다( 재료 표 참조).
  5. 염색된 부분을 현미경에 놓기: 염색된 부분을 현미경에 놓고 이미지가 선명하게 보일 때까지 현미경의 초점을 조정하고 배율을 40x로 설정한 다음 이미지를 캡처합니다.

6. 코 점막 조직의 다색 면역염색

  1. 탈왁스 및 수분 공급: 5.1단계에서 언급한 것과 동일하게 따르십시오.
  2. 구연산염-인산염 완충액 처리: 구연산염-인산염 완충액(pH 6.0)( 재료 표 참조)을 전자레인지용 용기에 넣습니다. 끓을 때까지 가열하고 제거한 다음 슬라이드를 용기에 추가합니다. 전자레인지에 중불로 8분간 끓을 때까지 돌리고 불을 8분간 끈 다음 중약불로 7분간 가열합니다.
    1. 자연 냉각 후 슬라이스를 PBS(pH 7.4)로 옮기고 흔든 다음 탈색 셰이커를 사용하여 매번 5분 동안 세 번 세척합니다.
      참고: 이 과정에서 버퍼가 증발하지 않도록 하고 슬라이스가 마르지 않도록 하십시오.
  3. 내인성 과산화효소 차단: 슬라이스를 건조시키고 면역조직화학 펜으로 조직 주위에 원을 그리고(항체가 흘러내리는 것을 방지하기 위해) 3% 과산화수소 용액(과산화수소: 순수한 물 = 1:9)을 적용합니다.
    1. 어두운 어두운 곳에서 15분 동안 실온에서 배양합니다. 자연 냉각 후 슬라이스를 PBS(pH 7.4)에 넣고 탈색 셰이커에 각각 5분씩 3회 주기로 흔듭니다.
  4. 차단: 원 안에 염소 혈청 5%를 바르고 30분 동안 배양합니다.
  5. 1차 항체 첨가: 차단 용액을 부드럽게 제거하고 FOXP3(희석: 1:200, 재료 표 참조)를 슬라이스에 첨가하고 습한 챔버에 넣습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    알림: 항체 증발을 방지하기 위해 습한 챔버에 소량의 물을 추가합니다.
  6. 2차 항체 추가: 슬라이스를 PBS(pH 7.4)에 넣고 탈색 셰이커에서 각각 5분씩 3회 주기로 흔듭니다. 슬라이스를 부드럽게 말리고 원 안에 2차 항체(Goat Anti-Rabbit IgG H&L, 재료 표 참조)를 도포합니다. 어두운 곳에서 실온에서 50분 동안 배양합니다.
  7. 티라미드 희석 용액의 제조: 100μL의 3%H2O2와 1x TBST 100mL를 결합합니다(재료 표 참조).
  8. TSA 작업 용액 추가: 티라미드 희석액 1mL와 CY3-티라미드 2μL를 혼합하여 TSA 작업 용액을 준비합니다. 각 슬라이스에 100μL의 TSA 작업 용액을 바르고 어두운 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 조각을 5분 동안 세 번 씻습니다.
    알림: TSA 작업 용액을 즉시 준비하여 사용하고 어두운 곳에서 4°C에 보관하십시오. 최대 24시간 동안 유효합니다.
  9. 6.2-6.8 단계를 반복합니다: RORγt(FITC 형광 염료)를 1:200 희석한 다음 TICAM1(TYP620 염료)을 1:200 희석으로 전환합니다( 재료 표 참조).
  10. DAPI 대조염색 핵: 슬라이스를 부드럽게 흔들어 건조시키고 DAPI 염색 용액을 바르고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  11. 자가형광 소멸: 슬라이스를 PBS(pH 7.4)에 넣고 탈색 셰이커에서 각각 5분씩 3회 주기 동안 흔듭니다. 자가형광 소광제( 재료 표 참조)를 슬라이스에 바르고 5분 동안 기다린 다음 10분 동안 세척합니다.
  12. 차단: 슬라이스를 PBS(pH 7.4)에 넣고 탈색 셰이커에 각각 5분씩 3회 주기로 흔듭니다. 슬라이스를 부드럽게 흔들어 말리고 형광 방지 담금질로 밀봉합니다( 재료 표 참조).
  13. 현미경 검사: 염색된 부분을 현미경에 놓고 선명한 가시성을 위해 현미경의 초점을 조정하고 배율을 20x 및 40x로 설정하고 이미지를 캡처합니다.
    참고: DAPI의 UV 여기 파장은 330-380nm이고 방출 파장은 420nm(청색광)입니다. FITC의 여기 파장은 465-495 nm이고 방출 파장은 515-555 nm(녹색광)입니다. CY3의 여기 파장은 510-560nm이고 방출 파장은 590nm(적색광)입니다. TYP-690은 여기 파장이 630nm이고 방출 파장이 690nm(분홍색 빛)입니다.

결과

6마리의 SD 쥐를 OVA 복강 내 주사 및 비강 챌린지를 통해 AR 모델에 성공적으로 유도했습니다. AR은 AR 그룹의 모든 쥐에서 유도되었으며, 그룹의 100%를 차지했습니다. AR 그룹의 모든 쥐는 재채기, 콧물, 코 가려움증과 같은 전형적인 증상을 보였습니다. 모든 행동 관찰은 ≥5점을 기록했다(표 2).

모델링 21일 째 H&E 염색 결과, 대조군 쥐에서 코 점막의 상피세?...

토론

알레르기 비염(AR)은 환경적 요인과 유전적 요인이 복합적으로 작용하여 발생하는 비감염성 비점막 염증성 질환입니다. 이는 업무 효율성에 영향을 미치고, 삶의 질을 떨어뜨리고, 수면, 인지 기능을 손상시키고, 과민성과 피로를 유발하는 세계적인 건강 문제가 되었습니다. AR은 전 세계 인구의 10%-20%에 영향을 미치며¹ 상당한 경제적 비용을 수반하여 EU 국가에서 연간 최대 30-500억 유로의 손실을 ...

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 쓰촨성 과학기술부(2021YJ0175)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% ethanolAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmmoniaChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anhydrous ethanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Anti-fluorescence quenching sealerSouthernBiotech0100-01
Automatic dyeing machineThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier slidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Citrate-phosphate buffer Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
CoverslipNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
CoverslipNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Decoloring shakerSCILOGEXS1010E
EDTA decalcification solutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Electric heating blast dryer Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fast tissue dewatering machineThermo scientificSTP420 ES
Film sealerThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Fluorescence microscopeSunny Optical Technology Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Freezing tableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Goat serumBiosharpBL210A
H&E staining kitLeageneDH0020
Hemostatic forcepsShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Hydrochloric acidSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Immunohistochemical penBiosharpBC004
Microwave ovenMideaM1-L213B
Neutral gumSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Palm centrifugeSCILOGEXD1008E
ParaformaldehydeBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Pathology section scanner3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS bufferBiosharpG4202
Pipette DragonKE0003087/KA0056573
RorγtAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
SlicerThermo scientificHM325
Slicing machineThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley ratsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-5554 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Tissue scissorsShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Tissue spreading baking sheet machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 fluorescent dyesShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Vortex mixerSCILOGEXSLK-O3000-S
Water bath-slide drierWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Wax trimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

참고문헌

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