Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica di immunofluorescenza multicolore per la valutazione del modello di rinite allergica nel ratto.

Abstract

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica e non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E specifiche (IgE), che colpisce circa il 10%-20% della popolazione mondiale. Mentre la colorazione a immunofluorescenza (IF) è stata a lungo una tecnica standard per rilevare l'espressione proteica specifica della malattia, le tecniche convenzionali di IF sono limitate nella loro capacità di rilevare i livelli di espressione di tre o più proteine nello stesso campione. Di conseguenza, negli ultimi anni sono state sviluppate tecniche di IF multicolore, che consentono la marcatura simultanea di più bersagli in cellule o tessuti.

Questo protocollo fornisce una panoramica completa del processo per stabilire un modello di ratto di AR, ottenere campioni di mucosa nasale e le procedure tecniche per l'immunofluorescenza multicolore. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso, con osservazioni comportamentali che hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha rivelato un aumento della conta delle cellule infiammatorie e un'integrità della mucosa nasale interrotta nel gruppo AR. L'immunofluorescenza multicolore (mIF) ha dimostrato un aumento dell'espressione di RORγt e TICAM-1, mentre l'espressione di Foxp3 è diminuita nel tessuto della mucosa nasale dei ratti AR.

Introduzione

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E (IgE) specifiche1,2. È caratterizzata da sintomi come starnuti, naso che cola, congestione nasale e prurito nasale. Con l'industrializzazione e l'urbanizzazione, la prevalenza dell'AR sta gradualmente aumentando, colpendo circa il 10%-20% della popolazione mondiale1. La tecnica dell'immunofluorescenza (IF) è un metodo di colorazione fluorescente che utilizza una reazione di legame anticorpo-antigene. Può essere impiegato per rilevare e quantificare la distribuzione e i livelli di espressione di proteine specifiche nei tessuti biologici o nelle cellule. Nella ricerca AR, l'IF può rilevare simultaneamente più bersagli, tra cui citochine correlate all'AR, cellule infiammatorie, recettori e altro ancora, facilitando l'esplorazione della patogenesi dell'AR e degli effetti dei farmaci 3,4,5,6.

Il processo di colorazione a immunofluorescenza multicolore (mIF) assomiglia molto all'IF, con l'aggiunta di una fase di eluizione dell'anticorpo durante ogni ciclo di colorazione. Questa modifica consente il rilevamento simultaneo di più biomarcatori sulla stessa sezione di tessuto attraverso una singola marcatura sequenziale e più cicli di ricolorazione. mIF si basa sull'amplificazione del segnale della tiramide (TSA), che consente cicli ripetuti di colorazione fluorescente TSA e l'uso del riscaldamento a microonde per rimuovere gli anticorpi mantenendo i segnali fluorescenti 7,8. Rispetto all'IF convenzionale, l'mIF offre diversi vantaggi: (1) è in grado di rilevare antigeni debolmente espressi che sono difficili da identificare con l'IFconvenzionale 9,10; (2) fornisce una colorazione di alta qualità con un migliore rapporto segnale/rumore; (3) consente di quantificare le strutture e le regioni di interesse tessuto-specifiche11; (4) il multiplexing di percorsi multipli utilizza in modo efficiente i tessuti e conserva risorse patologiche limitate12; (5) l'analisi multiparametrica attraverso mIF offre informazioni più approfondite sui tessuti, scoprendo informazioni biologiche nascoste13.

Nel complesso, mIF consente l'osservazione di diverse espressioni e distribuzioni dell'antigene all'interno dello stesso campione, facilitando lo studio delle proteine bersaglio. In futuro, i ricercatori che cercano di comprendere l'espressione e la distribuzione di più proteine bersaglio troveranno questa tecnica una scelta preziosa. Questo studio dimostra l'applicazione di mIF per la colorazione di campioni di mucosa nasale di ratti con AR e valuta la creazione di un modello di AR nel ratto.

Protocollo

Il protocollo e le procedure sperimentali hanno ricevuto l'approvazione del Comitato amministrativo e di ricerca sugli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di registrazione: 2022DL-010). I ratti maschi di Sprague Dawley (SD) di otto settimane, del peso di 180-200 g, sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in un ciclo naturale luce/buio con temperatura controllata (23 ± 2 °C) e umidità relativa (55% ± 10%). Dodici ratti sono stati divisi in modo casuale in due gruppi: il gruppo di controllo e il gruppo AR. Tutti i ratti sono stati acclimatati a queste condizioni e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua per una settimana prima della sperimentazione.

1. Creazione di un modello di ratto di AR

  1. Preparazione della soluzione sensibilizzante: sospendere 30 mg di ovoalbumina (OVA) e 3 g di Al(OH)3 in 100 mL di soluzione fisiologica (vedi Tabella dei Materiali)14,15.
  2. Sensibilizzazione di base: afferrare e tenere il ratto completamente sveglio con l'addome rivolto verso l'alto. Disinfettare l'addome utilizzando batuffoli di cotone imbevuti di alcol al 75%. Utilizzare una siringa da 1,5 mL per iniettare 1 mL della soluzione sensibilizzante preparata nella fase 1.1 nella cavità addominale sinistra dei ratti del gruppo AR. Ripeta l'iniezione una volta ogni due giorni per 14 giorni (Figura 1A).
    NOTA: Assicurarsi che la testa del ratto sia posizionata più in basso rispetto alla coda per evitare danni all'intestino crasso e tenue durante l'inserimento della siringa. Il sito di iniezione si trova a 1,5 cm dalla linea mediana ventrale. I ratti del gruppo di controllo devono ricevere iniezioni intraperitoneali di 1 mL di soluzione fisiologica normale una volta ogni due giorni per 14 giorni.
  3. Provocazione nasale: somministrare 50 μL di OVA al 5% tramite gocce nasali utilizzando una pipetta da 100 μL (Figura 1B) il giorno successivo alla sensibilizzazione basale, ripetendo questa procedura per 7 giorni (Figura 1C).
    NOTA: Preparare la soluzione di OVA al 5% mescolando 5 g di OVA con 100 mL di soluzione fisiologica. Per il gruppo di controllo, somministrare gocce dello stesso volume di soluzione fisiologica.

2. Punteggio comportamentale dei ratti

  1. Entro 30 minuti dal completamento della sfida nasale finale, osservare e registrare i ratti utilizzando una fotocamera digitale per identificare sintomi come grattarsi il naso, starnutire e naso che cola, in base ai criteri di punteggio delineati nella Tabella 1 (Figura 1D).
    NOTA: La conferma del successo della modellazione AR si basa sul raggiungimento di un punteggio totale di ≥5 punti14.

3. Acquisizione di campioni di mucosa nasale

  1. Sacrificare i ratti: sacrificare i ratti esponendoli a un'overdose di CO2 . Successivamente, disinfettare i ratti con etanolo al 75% (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lungo i due angoli della bocca per esporre il tessuto muscolare (Figura 2A). Successivamente, tagliare le articolazioni dell'osso zigomatico e della mandibola su entrambi i lati del cranio utilizzando delle forbici per tessuti (Figura 2B) e rimuovere la mandibola (Figura 2C).
  2. Esposizione della cavità nasale: separare la pelle della mascella utilizzando un emostatico (Figura 2D) per esporre la cavità nasale (Figura 2E). Tagliare la connessione ossea tra la cavità nasale e la mascella con delle forbici per tessuti (Figura 2F). Quindi, recidere la connessione tra la cavità nasale e le ossa orbitali su entrambi i lati del forame infraorbitale (Figura 2G) e rimuovere la cavità nasale (Figura 2H).
  3. Fissazione: porre la cavità nasale estratta in paraformaldeide al 4% per il fissaggio e conservarla a temperatura ambiente per 24-72 h (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: Assicurarsi che la quantità di fissativo paraformaldeide utilizzata sia sufficiente a coprire completamente le sezioni per un corretto fissaggio.

4. Pre-trattamento di campioni di mucosa nasale

  1. Decalcificazione: iniziare fissando i tessuti rimossi dal punto 3.1. Lavali tre volte con PBS per 20 minuti ciascuno. Seguili lavandoli tre volte con acqua distillata, ogni volta per 20 minuti. Successivamente, decalcificare i tessuti in una soluzione di decalcificazione con un volume di 20-30 volte quello dei tessuti a temperatura ambiente.
    1. La soluzione di decalcificazione (vedi Tabella dei Materiali) deve mantenere un pH di 7,2-7,4. Infine, metti il tessuto decalcificato in una scatola di disidratazione.
      NOTA: La soluzione decalcificante deve essere cambiata settimanalmente. Il processo di decalcificazione può concludersi quando il tessuto si ammorbidisce (circa 2 mesi).
  2. Disidratazione e ceretta: trasferire la scatola di disidratazione in un disidratatore (vedi Tabella dei materiali). Inizia con il 75% di alcol per 4 ore, seguito dall'85% di alcol per 2 ore, dal 90% di alcol per 2 ore e dal 95% di alcol per 1 ora.
    1. Successivamente, immergere il tessuto in etanolo anidro per 30 minuti, ripetere il processo per altri 30 minuti, utilizzare lo xilene per 5-10 minuti, ripetere questo passaggio per altri 5-10 minuti, immergere il tessuto nella cera per 1 ora, ripetere questo passaggio per un'altra ora e, infine, immergere il tessuto nella cera per un'altra 1 ora.
  3. Incasso: posizionare il blocco di cera fusa nella scatola da incasso (vedi Tabella dei materiali) e conservarlo in un congelatore a -20 °C. Una volta che la cera si è solidificata, rimuoverla e tagliare il blocco di cera.
  4. Affettatura: inserire il blocco di cera rifilato in un microtomo di paraffina (vedi Tabella dei materiali) e tagliarlo a fette dello spessore di 3 μm. Mettere le fette a bagnomaria a 40 °C su uno spargivetrino. Appiattire il fazzoletto, quindi sollevarlo con un vetrino e cuocerlo in forno a 60 °C.
    1. Dopo che l'acqua è evaporata e la cera è stata fissata correttamente, rimuovere i vetrini e conservarli a una temperatura di 25 °C.

5. Colorazione H&E del tessuto mucoso nasale

  1. Deceratura e idratazione: mettere le fette in xilene per 20 min, ripetere il processo per altri 20 min, etanolo assoluto per 5 min, ripetere questo passaggio per altri 5 min, alcol al 75% per 5 min, e infine, lavare per 5 min.
  2. Colorazione con ematossilina: erogare 100 μL di soluzione colorante con ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per 3-5 minuti utilizzando una pipetta da 100 μL, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di etanolo acido cloridrico allo 0,5% per 10-30 s, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di acqua ammoniacale allo 0,2% per 10-30 s e risciacquare per 30 s.
    NOTA: Dopo la colorazione con ematossilina, è necessaria la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5% per rimuovere il colorante ematossilico in eccesso legato al nucleo e assorbito dal citoplasma. Quando viene eseguita la colorazione con eosina, i nuclei e il citoplasma saranno chiaramente colorati. Le fette appariranno rosse o rosa dopo la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5%, quindi risciacquare immediatamente dopo la differenziazione per rimuovere l'acido dalle fette di tessuto per arrestare la differenziazione. Quindi, utilizzare lo 0,2% di acqua ammoniacale per migliorare la colorazione nucleare.
  3. Colorazione con eosina: utilizzare una pipetta da 100 μL per erogare 100 μL di soluzione colorante con eosina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti e risciacquare per 30 s.
  4. Disidratazione e sigillatura: immergere le fette in etanolo assoluto per 5 minuti, ripetere il processo per altri 5 minuti, ripetere ancora una volta per 5 minuti, dimetile per 5 minuti e xilene per 5 minuti. Infine, sigillare con resina neutra (vedi Tabella dei Materiali).
  5. Posizionamento della sezione colorata sul microscopio: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando l'immagine non è chiaramente visibile, impostare l'ingrandimento su 40x e acquisire l'immagine.

6. Immunocolorazione multicolore del tessuto mucoso nasale

  1. Deceratura e idratazione: seguire le stesse indicazioni del punto 5.1.
  2. Trattamento tampone citrato-fosfato: mettere il tampone citrato-fosfato (pH 6,0) (vedi Tabella dei materiali) in un contenitore adatto al microonde. Scaldare fino a ebollizione, rimuoverlo e quindi aggiungere i vetrini al contenitore. Microonde a fuoco medio per 8 minuti fino a ebollizione, spegnere il fuoco per 8 minuti, quindi passare a fuoco medio-basso per 7 minuti.
    1. Dopo il raffreddamento naturale, trasferire le fette in PBS (pH 7,4), agitarle e lavarle tre volte con uno shaker decolorante, ogni volta per 5 min.
      NOTA: Assicurarsi che il tampone non evapori durante questo processo ed evitare che le fette si secchino.
  3. Bloccare la perossidasi endogena: asciugare le fette, tracciare un cerchio attorno al tessuto con una penna immunoistochimica (per evitare che l'anticorpo defluisca) e applicare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% (acqua ossigenata: acqua pura = 1:9).
    1. Incubare a temperatura ambiente al buio per 15 min. Dopo il raffreddamento naturale, porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno.
  4. Bloccante: applicare il siero di capra al 5% all'interno del cerchio e incubare per 30 min.
  5. Aggiunta di anticorpi primari: rimuovere delicatamente la soluzione bloccante, aggiungere FOXP3 (diluizione: 1:200, vedere la tabella dei materiali) alla fetta e porla in una camera umida. Incubare a 4 °C per una notte.
    NOTA: Aggiungere una piccola quantità d'acqua nella camera umida per evitare l'evaporazione degli anticorpi.
  6. Aggiunta di anticorpi secondari: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 minuti ciascuno. Asciugare delicatamente le fette e applicare l'anticorpo secondario (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, vedi Tabella dei materiali) all'interno del cerchio. Incubare a temperatura ambiente per 50 minuti al buio.
  7. Preparazione della soluzione di diluizione di tiramide: combinare 100 μL di H 2 O2al 3% con 100 mL di 1x TBST (vedi tabella dei materiali).
  8. Aggiunta di soluzione di lavoro TSA: Miscelare 1 mL di diluente di tiramide con 2 μL di CY3-tiramide per preparare la soluzione di lavoro TSA. Applicare 100 μL di soluzione di lavoro TSA su ciascuna fetta e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Quindi, lavare le fette con PBS tre volte, 5 minuti ogni volta.
    NOTA: Preparare e utilizzare immediatamente la soluzione di lavoro TSA e conservarla al buio a 4 °C; È valido per un massimo di 24 ore.
  9. Ripetere i passaggi 6.2-6.8: passare a una diluizione 1:200 di RORγt (colorante fluorescente FICC) e poi a una diluizione 1:200 di TICAM1 (colorante TYP620) (vedi Tabella dei materiali).
  10. Nuclei controcolorati DAPI: agitare delicatamente le fette per asciugarle, applicare la soluzione colorante DAPI e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
  11. Autofluorescenza di tempra: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Applicare il quencher di autofluorescenza (vedere Tabella dei materiali) sulle fette, attendere 5 minuti, quindi lavare per 10 minuti.
  12. Bloccaggio: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Agitare delicatamente le fette per asciugarle e sigillarle con il quencher antifluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
  13. Microscopia: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio per una chiara visibilità, impostare l'ingrandimento su 20x e 40x e acquisire l'immagine.
    NOTA: DAPI ha una lunghezza d'onda di eccitazione UV di 330-380 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (luce blu). FITC ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 465-495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 515-555 nm (luce verde). CY3 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 510-560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm (luce rossa). TYP-690 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 630 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 690 nm (luce rosa).

Risultati

Sei ratti SD sono stati indotti con successo nel modello AR attraverso l'iniezione intraperitoneale OVA e la sfida nasale. L'AR è stata indotta in tutti i ratti del gruppo AR, che rappresentavano il 100% del gruppo. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso. Tutte le osservazioni comportamentali hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti (Tabella 2).

I risultati della colorazione H&E al 21° giorno di mo...

Discussione

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria non infettiva della mucosa nasale derivante da una combinazione di fattori ambientali e genetici. È diventato un problema di salute globale, che ha un impatto sull'efficienza lavorativa, diminuisce la qualità della vita, compromette il sonno, la funzione cognitiva e causa irritabilità e affaticamento. L'AR colpisce il 10%-20% della popolazione mondiale¹ e comporta costi economici considerevoli, causando perdite annuali fino a 30-50 miliardi di euro nei paesi dell...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2021YJ0175).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% ethanolAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmmoniaChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anhydrous ethanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Anti-fluorescence quenching sealerSouthernBiotech0100-01
Automatic dyeing machineThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier slidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Citrate-phosphate buffer Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
CoverslipNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
CoverslipNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Decoloring shakerSCILOGEXS1010E
EDTA decalcification solutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Electric heating blast dryer Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fast tissue dewatering machineThermo scientificSTP420 ES
Film sealerThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Fluorescence microscopeSunny Optical Technology Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Freezing tableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Goat serumBiosharpBL210A
H&E staining kitLeageneDH0020
Hemostatic forcepsShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Hydrochloric acidSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Immunohistochemical penBiosharpBC004
Microwave ovenMideaM1-L213B
Neutral gumSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Palm centrifugeSCILOGEXD1008E
ParaformaldehydeBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Pathology section scanner3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS bufferBiosharpG4202
Pipette DragonKE0003087/KA0056573
RorγtAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
SlicerThermo scientificHM325
Slicing machineThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley ratsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-5554 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Tissue scissorsShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Tissue spreading baking sheet machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 fluorescent dyesShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Vortex mixerSCILOGEXSLK-O3000-S
Water bath-slide drierWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Wax trimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

Riferimenti

  1. Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
  2. Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
  3. Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
  4. Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
  5. Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
  6. Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  7. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  8. Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  9. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
  10. Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
  11. Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
  12. Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
  13. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  14. Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
  15. Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
  16. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).
  17. Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
  18. Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
  19. Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
  20. Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
  21. Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
  22. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
  23. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  24. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  25. Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
  26. Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
  27. Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
  28. Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
  29. Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
  30. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  31. Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  32. Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
  33. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  34. Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Marcatura immunofluorescentesezioni di tessuto della mucosa nasalerinite allergicarattitest immunologico multicoloreimmunoglobulina E specificacolorazione IFespressione proteica specifica della malattiatecniche IF multicoloremodello di ratto di ARcampioni di mucosa nasaleimmunofluorescenza multicoloresintomi di ARstarnutinaso che colaprurito al nasoconta delle cellule infiammatorieintegrit della mucosa nasaleespressione ROR tespressione TICAM 1espressione Foxp3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati