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本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

该方案描述了一种用于评估过敏性鼻炎大鼠模型的多色免疫荧光技术。

摘要

过敏性鼻炎 （AR） 是一种慢性、非感染性鼻粘膜炎症性疾病，主要由特异性免疫球蛋白 E （IgE） 介导，影响全球约 10%-20% 的人口。虽然免疫荧光 （IF） 染色长期以来一直是检测疾病特异性蛋白质表达的标准技术，但传统的 IF 技术在检测同一样品中三种或更多蛋白质的表达水平的能力方面受到限制。因此，近年来开发了多色IF技术，可以同时标记细胞或组织中的多个靶标。

该协议全面概述了建立AR大鼠模型，获取鼻粘膜样本以及多色免疫荧光技术程序的过程。AR组所有大鼠均出现打喷嚏、流鼻涕、鼻痒等典型症状，行为观察得分为≥5分。苏木精和伊红 （H&E） 染色显示 AR 组的炎症细胞计数增加并破坏鼻粘膜完整性。多色免疫荧光（mIF）显示AR大鼠鼻黏膜组织中RORγt和TICAM-1的表达增加，而Foxp3的表达降低。

引言

过敏性鼻炎 （AR） 是一种慢性、非感染性鼻粘膜炎症性疾病，主要由特异性免疫球蛋白 E （IgE） 介导1,2。它的特点是打喷嚏、流鼻涕、鼻塞和鼻痒等症状。随着工业化和城市化，AR的流行率逐渐增加，影响了全球约10%-20%的人口1。免疫荧光 （IF） 技术是一种利用抗体-抗原结合反应的荧光染色方法。它可用于检测和定量特定蛋白质在生物组织或细胞中的分布和表达水平。在AR研究中，IF可以同时检测多个靶点，包括AR相关细胞因子、炎症细胞、受体等，有助于探索AR的发病机制和药物的作用3,4,5,6。

多色免疫荧光 （mIF） 染色过程与传统 IF 非常相似，在每轮染色过程中都增加了一个抗体洗脱步骤。这种修饰能够通过连续的单标记和多轮重新染色同时检测同一组织切片上的多个生物标志物。mIF 基于酪胺信号放大 （TSA），允许重复循环进行 TSA 荧光染色，并使用微波加热去除抗体，同时保留荧光信号 7,8

研究方案

实验方案和程序已获得成都中医药大学行政和动物研究委员会的批准（备案号：2022DL-010）。从商业上获得8周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重为180-200g（见 材料表），并在受控温度（23±2°C）和相对湿度（55%±10%）的自然光/暗循环下饲养。将12只大鼠随机分为两组：对照组和AR组。所有大鼠都适应了这些条件，并在试验前一周免费获得食物和水。

1. AR大鼠模型的建立

  1. 制备致敏溶液：将 30 mg 卵清蛋白 （OVA） 和 3 g Al（OH）3 悬浮在 100 mL 盐水中（见材料表）14,15。
  2. 基本致敏：抓住并握住完全清醒的大鼠，使其腹部朝上。用75%酒精浸泡的棉球对腹部进行消毒。使用1.5mL注射器将步骤1.1中制备的1mL敏化溶液注射到AR组大鼠的左腹腔中。每两天重复一次注射，持续14天（图1A）。
    注意： 确保大鼠的头部低于尾巴的位置，以防止插入注射器时对大肠和小肠造成损伤。注射部位位于距腹侧中线 1.5 厘米处。对照组大鼠应每两天腹腔注射一次1mL生理盐水，持续14天。

代表性结果

通过OVA腹腔注射和鼻腔激发成功诱导6只SD大鼠进入AR模型。AR组所有大鼠均诱导AR，占该组的100%。AR组所有大鼠均出现打喷嚏、流鼻涕、鼻痒等典型症状。所有行为观察得分≥5分（表2）。

建模第21天H &E染色结果显示，对照大鼠鼻黏膜上皮细胞和纤毛排列良好，无炎症细胞浸润迹象。相反，在AR组中，鼻中隔的粘膜受损并脱落，并伴有明显的中性粒细胞浸润.......

讨论

过敏性鼻炎（AR）是一种非感染性鼻粘膜炎症性疾病，由环境和遗传因素共同引起。它已成为一个全球健康问题，影响工作效率，降低生活质量，损害睡眠、认知功能，并引起烦躁和疲劳。AR 影响着全球 10%-20% 的人口¹，并带来巨大的经济成本，每年在欧盟国家造成高达 30-500 亿欧元的损失18.此外，几项研究已经确定了 AR 与哮喘之间的密切关联18,19,20

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了四川省科学技术厅（2021YJ0175）的支持。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% ethanolAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmmoniaChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anhydrous ethanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Anti-fluorescence quenching sealerSouthernBiotech0100-01
Automatic dyeing machineThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier slidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Citrate-phosphate buffer Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
CoverslipNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
CoverslipNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Decoloring shakerSCILOGEXS1010E
EDTA decalcification solutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Electric heating blast dryer Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fast tissue dewatering machineThermo scientificSTP420 ES
Film sealerThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Fluorescence microscopeSunny Optical Technology Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Freezing tableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Goat serumBiosharpBL210A
H&E staining kitLeageneDH0020
Hemostatic forcepsShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Hydrochloric acidSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Immunohistochemical penBiosharpBC004
Microwave ovenMideaM1-L213B
Neutral gumSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Palm centrifugeSCILOGEXD1008E
ParaformaldehydeBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Pathology section scanner3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS bufferBiosharpG4202
Pipette DragonKE0003087/KA0056573
RorγtAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
SlicerThermo scientificHM325
Slicing machineThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley ratsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-5554 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Tissue scissorsShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Tissue spreading baking sheet machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 fluorescent dyesShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Vortex mixerSCILOGEXSLK-O3000-S
Water bath-slide drierWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Wax trimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

参考文献

  1. Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
  2. Maurer, M., Zuberbier, T.

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