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Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.

Resumo

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E específica (IgE), afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial. Enquanto a coloração por imunofluorescência (IF) tem sido uma técnica padrão para detectar a expressão de proteínas doença-específicas, as técnicas convencionais de FI são limitadas em sua capacidade de detectar os níveis de expressão de três ou mais proteínas na mesma amostra. Consequentemente, técnicas de FI multicolorido têm sido desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a marcação simultânea de múltiplos alvos em células ou tecidos.

Este protocolo fornece uma visão abrangente do processo para o estabelecimento de um modelo de RA em ratos, obtenção de amostras de mucosa nasal e procedimentos técnicos para imunofluorescência multicolorida. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz, com observações comportamentais pontuando ≥5 pontos. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou aumento da contagem de células inflamatórias e integridade da mucosa nasal no grupo RA. A imunofluorescência multicolor (mIF) demonstrou aumento da expressão de RORγt e TICAM-1, enquanto a expressão de Foxp3 diminuiu no tecido da mucosa nasal de ratos RA.

Introdução

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E (IgE) específica1,2. É caracterizada por sintomas como espirros, coriza, congestão nasal e prurido nasal. Com a industrialização e urbanização, a prevalência da RA vem aumentando gradativamente, afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial1. A técnica de imunofluorescência (IF) é um método de coloração fluorescente que utiliza uma reação de ligação anticorpo-antígeno. Pode ser empregado para detectar e quantificar os níveis de distribuição e expressão de proteínas específicas em tecidos biológicos ou células. Na pesquisa de RA, o FI pode detectar simultaneamente múltiplos alvos, incluindo citocinas relacionadas à RA, células inflamatórias, receptores e muito mais, facilitando a exploração da patogênese da RA e dos efeitos de drogas 3,4,5,6.

O processo de coloração por imunofluorescência multicolor (mIF) se assemelha muito ao FI tradicional, com a adição de uma etapa de eluição de anticorpos durante cada rodada de coloração. Essa modificação permite a detecção simultânea de múltiplos biomarcadores na mesma seção de tecido por meio de marcação única sequencial e várias rodadas de recoloração. O mIF é baseado na amplificação do sinal da tiramida (TSA), permitindo ciclos repetidos de coloração fluorescente de TSA e o uso de aquecimento por micro-ondas para remover anticorpos enquanto retém sinais fluorescentes 7,8. Em comparação com o FI convencional, o mIF oferece várias vantagens: (1) pode detectar antígenos fracamente expressos que são difíceis de identificar com o IF convencional 9,10; (2) proporciona coloração de alta qualidade com melhor relação sinal-ruído; (3) permite quantificar estruturas tecido-específicas e regiões de interesse11; (4) a multiplexação de múltiplas vias utiliza tecidos de forma eficiente e conserva recursos patológicos limitados12; (5) a análise multiparamétrica por meio do mIF oferece informações mais profundas sobre os tecidos, revelando informações biológicas ocultas13.

De modo geral, o mIF permite a observação de diferentes expressões e distribuições de antígenos dentro de uma mesma amostra, facilitando o estudo das proteínas-alvo. No futuro, pesquisadores que buscam entender a expressão e distribuição de múltiplas proteínas-alvo encontrarão essa técnica como uma escolha valiosa. Este estudo demonstra a aplicação do mIF na coloração de amostras de mucosa nasal de ratos com RA e avalia o estabelecimento de um modelo de RA em ratos.

Protocolo

O protocolo e os procedimentos experimentais receberam aprovação do Comitê Administrativo e de Pesquisa Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Ratos machos Sprague Dawley (SD), com oito semanas de idade, pesando entre 180 e 200 g, foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados sob um ciclo claro/escuro natural com temperatura (23 ± 2 °C) e umidade relativa (55% ± 10%) controladas. Doze ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo controle e grupo RA. Todos os ratos foram aclimatados a essas condições e receberam acesso gratuito a comida e água por uma semana antes do experimento.

1. Estabelecimento de um modelo de RA em ratos

  1. Preparo da solução sensibilizante: suspender 30 mg de ovalbumina (OVA) e 3 g de Al(OH)3 em 100 mL de solução salina (ver Tabela de Materiais)14,15.
  2. Sensibilização básica: segure e segure o rato totalmente acordado com o abdômen voltado para cima. Desinfete o abdômen usando bolas de algodão embebidas em álcool a 75%. Utilizar uma seringa de 1,5 ml para injectar 1 ml da solução sensibilizante preparada no passo 1.1 na cavidade abdominal esquerda dos ratos do grupo RA. Repetir esta injeção uma vez a cada dois dias durante 14 dias (Figura 1A).
    NOTA: Certifique-se de que a cabeça do rato está posicionada mais abaixo da cauda para evitar danos aos intestinos grosso e delgado ao inserir a seringa. O local da injeção está localizado a 1,5 cm da linha média ventral. Os ratos do grupo controle devem receber injeções intraperitoneais de 1 mL de solução salina normal uma vez a cada dois dias por 14 dias.
  3. Provocação nasal: Administrar 50 μL de OVA a 5% por meio de gotas nasais utilizando pipeta de 100 μL (Figura 1B) no dia seguinte à sensibilização basal, repetindo este procedimento por 7 dias (Figura 1C).
    NOTA: Preparar a solução de OVA a 5% misturando 5 g de OVA com 100 ml de solução salina. Para o grupo controle, administrar gotas do mesmo volume de soro fisiológico.

2. Escore comportamental de ratos

  1. Dentro de 30 min após completar o teste nasal final, observar e registrar os ratos usando uma câmera digital para identificar sintomas como coçar o nariz, espirrar e coriza, com base nos critérios de pontuação descritos na Tabela 1 (Figura 1D).
    NOTA: A confirmação de que a modelagem de RA bem-sucedida é baseada na obtenção de uma pontuação total de ≥5 pontos14.

3. Obtenção de amostras de mucosa nasal

  1. Sacrificar ratos: sacrificar os ratos expondo-os a uma overdose de CO2. Depois, desinfetar os ratos com etanol a 75% (ver Tabela de Materiais). Utilizar bisturi para incisão nos dois cantos da boca para exposição do tecido muscular (Figura 2A). Em seguida, cortar as articulações do osso zigomático e da mandíbula em ambos os lados do crânio com tesoura de tecido (Figura 2B) e remover a mandíbula (Figura 2C).
  2. Exposição da cavidade nasal: separar a pele da maxila com hemostático (Figura 2D) para expor a cavidade nasal (Figura 2E). Cortar a conexão óssea entre a cavidade nasal e a maxila com tesoura de tecido (Figura 2F). Em seguida, cortar a conexão entre a cavidade nasal e os ossos orbitários de ambos os lados no forame infraorbital (Figura 2G) e remover a cavidade nasal (Figura 2H).
  3. Fixação: colocar a cavidade nasal extraída em paraformaldeído a 4% para fixação e armazená-la em temperatura ambiente por 24-72 h (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Certifique-se de que a quantidade de paraformaldeído fixador utilizada é suficiente para cobrir completamente as seções para a fixação adequada.

4. Pré-processamento de amostras de mucosa nasal

  1. Descalcificação: comece fixando os tecidos retirados a partir do passo 3.1. Lave-os três vezes com PBS por 20 min cada. Em seguida, lave-os três vezes com água destilada, cada vez por 20 min. Posteriormente, descalcifique os tecidos em uma solução de descalcificação com um volume de 20-30 vezes o dos tecidos à temperatura ambiente.
    1. A solução de descalcificação (ver Tabela de Materiais) deve manter um pH de 7,2-7,4. Finalmente, coloque o tecido descalcificado em uma caixa de desidratação.
      NOTA: A solução descalcificante precisa ser trocada semanalmente. O processo de descalcificação pode ser concluído quando o tecido amolece (aproximadamente 2 meses).
  2. Desidratação e depilação: transfira a caixa de desidratação para um desidratador (ver Tabela de Materiais). Comece com álcool 75% por 4 h, seguido por álcool 85% por 2 h, álcool 90% por 2 h e álcool 95% por 1 h.
    1. Em seguida, imergir o tecido em etanol anidro por 30 min, repetir o processo por mais 30 min, usar xileno por 5-10 min, repetir essa etapa por mais 5-10 min, imergir o tecido em cera por 1 h, repetir essa etapa por mais uma hora e, finalmente, imergir o tecido em cera por mais 1 h.
  3. Incorporação: coloque o bloco de cera derretida na caixa de incorporação (consulte Tabela de Materiais) e guarde-o em um freezer de -20 °C. Assim que a cera se solidificar, retire-a e apague o bloco de cera.
  4. Fatiamento: insira o bloco de cera aparado em micrótomo de parafina (ver Tabela de Materiais) e corte-o em fatias com espessura de 3 μm. Coloque as fatias em banho-maria a 40 °C sobre um espalhador de lâminas. Achate o tecido, levante-o com uma lâmina de vidro e leve ao forno a 60 °C.
    1. Depois que a água tiver evaporado e a cera estiver devidamente ajustada, remova as lâminas e armazene-as a uma temperatura de 25 °C.

5. Coloração H&E do tecido da mucosa nasal

  1. Desparafinação e hidratação: coloque as fatias em xileno por 20 min, repita o processo por mais 20 min, etanol absoluto por 5 min, repita essa etapa por mais 5 min, álcool 75% por 5 min e, por fim, lave por 5 min.
  2. Coloração de hematoxilina: dispensar 100 μL de solução corante de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 3-5 min usando uma pipeta de 100 μL, enxaguar por 5-10 s, adicionar 100 μL de etanol de ácido clorídrico a 0,5% por 10-30 s, enxaguar por 5-10 s, adicionar 100 μL de água de amônia a 0,2% por 10-30 s e enxaguar por 30 s.
    NOTA: Após a coloração com hematoxilina, a diferenciação com etanol de ácido clorídrico a 0,5% é necessária para remover o excesso de corante hematoxilina ligado ao núcleo e absorvido pelo citoplasma. Quando a coloração de eosina é realizada, os núcleos e o citoplasma serão claramente corados. As fatias aparecerão vermelhas ou rosas após a diferenciação com etanol de ácido clorídrico a 0,5%, então enxágue imediatamente após a diferenciação para remover o ácido das fatias de tecido para interromper a diferenciação. Em seguida, use 0,2% de água de amônia para melhorar a coloração nuclear.
  3. Coloração de eosina: utilizar uma pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solução corante de eosina (ver Tabela de Materiais) por 5 min e enxaguar por 30 s.
  4. Desidratação e selagem: imergir as fatias em etanol absoluto por 5 min, repetir o processo por mais 5 min, repetir novamente por 5 min, dimetil por 5 min e xileno por 5 min. Por fim, selar com resina neutra (ver Tabela de Materiais).
  5. Colocação do corte corado no microscópio: posicione o corte corado no microscópio, ajuste o foco do microscópio até que a imagem fique claramente visível, ajuste o aumento para 40x e capture a imagem.

6. Imunomarcação multicolor do tecido da mucosa nasal

  1. Desparafinação e hidratação: siga o mesmo mencionado no passo 5.1.
  2. Tratamento tampão citrato-fosfato: colocar o tampão citrato-fosfato (pH 6,0) (ver Tabela de Materiais) em um recipiente seguro para micro-ondas. Aqueça até ferver, remova-o e, em seguida, adicione as lâminas ao recipiente. Leve ao micro-ondas em fogo médio por 8 min até ferver, desligue o fogo por 8 min e mude para fogo médio-baixo por 7 min.
    1. Após o resfriamento natural, transfira as fatias para PBS (pH 7,4), agite e lave-as três vezes com um agitador descolorante, cada vez por 5 min.
      NOTA: Certifique-se de que o tampão não evapora durante este processo e evite que as fatias sequem.
  3. Bloqueio da peroxidase endógena: secar as fatias, desenhar um círculo ao redor do tecido com uma caneta imunohistoquímica (para evitar que o anticorpo flua) e aplicar solução de peróxido de hidrogênio a 3% (peróxido de hidrogênio: água pura = 1:9).
    1. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 15 minutos. Após o resfriamento natural, coloque as fatias em PBS (pH 7,4) e agite-as em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada.
  4. Bloqueio: aplicar 5% de soro de cabra dentro do círculo e incubar por 30 min.
  5. Adição de anticorpos primários: remova suavemente a solução de bloqueio, adicione FOXP3 (diluição: 1:200, ver Tabela de Materiais) ao corte e coloque-o numa câmara húmida. Incubar a 4 °C durante a noite.
    NOTA: Adicione uma pequena quantidade de água à câmara úmida para evitar a evaporação de anticorpos.
  6. Adição de anticorpos secundários: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Seque suavemente as fatias e aplique o anticorpo secundário (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, ver Tabela de Materiais) dentro do círculo. Incubar à temperatura ambiente durante 50 minutos no escuro.
  7. Preparação da solução de diluição de tiramida: combinar 100 μL de 3% H 2 O2com 100 ml de 1x TBST (ver Tabela de Materiais).
  8. Adição de solução de trabalho TSA: Misturar 1 ml de diluente de tiramida com 2 μL de CY3-tiramida para preparar a solução de trabalho TSA. Aplicar 100 μL de solução de trabalho TSA em cada fatia e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 10 minutos. Em seguida, lave as fatias com PBS três vezes, 5 min cada vez.
    NOTA: Preparar e utilizar imediatamente a solução de trabalho TSA e armazená-la a 4 °C no escuro; É válido por até 24 h.
  9. Repita os passos 6.2-6.8: mudar para uma diluição de 1:200 de RORγt (corante fluorescente FITC) e, em seguida, para uma diluição de 1:200 de TICAM1 (corante TYP620) (ver Tabela de Materiais).
  10. Núcleos contracorados com DAPI: agitar suavemente as fatias para secá-las, aplicar solução corante DAPI e incubar à temperatura ambiente por 10 min no escuro.
  11. Têmpera autofluorescente: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Aplique o quencher de autofluorescência (ver Tabela de Materiais) nas fatias, aguarde 5 min e lave por 10 min.
  12. Bloqueio: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Agite suavemente as fatias para secá-las e selá-las com o quencher antifluorescência (ver Tabela de Materiais).
  13. Microscopia: colocar o corte corado no microscópio, ajustar o foco do microscópio para visibilidade clara, ajustar o aumento para 20x e 40x e capturar a imagem.
    NOTA: DAPI tem um comprimento de onda de excitação UV de 330-380 nm e um comprimento de onda de emissão de 420 nm (luz azul). O FITC tem um comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um comprimento de onda de emissão de 515-555 nm (luz verde). CY3 tem um comprimento de onda de excitação de 510-560 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm (luz vermelha). TYP-690 tem um comprimento de onda de excitação de 630 nm e um comprimento de onda de emissão de 690 nm (luz rosa).

Resultados

Seis ratos SD foram induzidos com sucesso no modelo de RA através de injeção intraperitoneal de OVA e desafio nasal. A RA foi induzida em todos os ratos do grupo RA, correspondendo a 100% do grupo. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz. Todas as observações comportamentais obtiveram pontuação ≥5 pontos (Tabela 2).

Os resultados da coloração H&E no21º dia de modelagem revelaram que, nos ratos co...

Discussão

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória não infecciosa da mucosa nasal resultante de uma combinação de fatores ambientais e genéticos. Tornou-se um problema de saúde global, impactando a eficiência do trabalho, diminuindo a qualidade de vida, prejudicando o sono, a função cognitiva e causando irritabilidade e fadiga. A RA afeta 10%-20% da população mundial¹ e acarreta custos econômicos substanciais, causando perdas anuais de até 30-50 bilhões de euros nos países da UE18...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2021YJ0175).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% ethanolAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmmoniaChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anhydrous ethanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Anti-fluorescence quenching sealerSouthernBiotech0100-01
Automatic dyeing machineThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier slidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Citrate-phosphate buffer Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
CoverslipNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
CoverslipNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Decoloring shakerSCILOGEXS1010E
EDTA decalcification solutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Electric heating blast dryer Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fast tissue dewatering machineThermo scientificSTP420 ES
Film sealerThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Fluorescence microscopeSunny Optical Technology Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Freezing tableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Goat serumBiosharpBL210A
H&E staining kitLeageneDH0020
Hemostatic forcepsShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Hydrochloric acidSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Immunohistochemical penBiosharpBC004
Microwave ovenMideaM1-L213B
Neutral gumSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Palm centrifugeSCILOGEXD1008E
ParaformaldehydeBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Pathology section scanner3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS bufferBiosharpG4202
Pipette DragonKE0003087/KA0056573
RorγtAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
SlicerThermo scientificHM325
Slicing machineThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley ratsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-5554 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Tissue scissorsShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Tissue spreading baking sheet machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 fluorescent dyesShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Vortex mixerSCILOGEXSLK-O3000-S
Water bath-slide drierWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Wax trimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

Referências

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