Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Resumen

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Resumen

La secuenciación unicelular ha permitido el mapeo de poblaciones celulares heterogéneas en el estroma de los órganos hematopoyéticos. Estas metodologías proporcionan una lente a través de la cual estudiar la heterogeneidad no resuelta previamente en estado estacionario, así como los cambios en la representación del tipo de célula inducidos por tensiones extrínsecas o durante el envejecimiento. Aquí, presentamos protocolos paso a paso para el aislamiento de poblaciones de células estromales de alta calidad de timo murino y humano, así como de hueso murino y médula ósea. Las celdas aisladas a través de estos protocolos son adecuadas para generar conjuntos de datos multiómicos de una sola celda de alta calidad. Aquí se analizan los impactos de la digestión de la muestra, el agotamiento del linaje hematopoyético, el análisis/clasificación FACS y cómo estos factores influyen en la compatibilidad con la secuenciación de una sola célula. Con ejemplos de perfiles FACS que indican una disociación exitosa e ineficiente y rendimientos de células estromales aguas abajo en el análisis posterior a la secuenciación, se proporcionan indicadores reconocibles para los usuarios. Tener en cuenta los requisitos específicos de las células estromales es crucial para obtener resultados reproducibles y de alta calidad que puedan avanzar en el conocimiento en el campo.

Introducción

En el adulto sano, la producción de novo de células sanguíneas se produce en la médula ósea y el timo. Las células estromales en estos sitios son esenciales para el mantenimiento de la hematopoyesis, pero el estroma constituye menos del 1% del tejido 1,2,3,4. Por lo tanto, la obtención de aislados puros de estroma portador de hematopoyesis constituye un desafío importante, particularmente para la multiómica unicelular que requiere un procesamiento oportuno para obtener muestras de alta calidad. Los componentes de diferentes cócteles de diges....

Protocolo

Todo el trabajo con tejido humano se llevó a cabo después de la aprobación de la Junta de Revisión Interna (IRB) del Hospital General de Massachusetts. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones C57Bl/6, de 8 a 10 semanas de edad, machos y hembras. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación del tejido tímico murino

1. Prepare los siguientes tampones y soluciones.
   ....

Discusión

Las células estromales de los órganos hematopoyéticos son fundamentales para la producción normal de sangre y las perturbaciones del estroma hematopoyético pueden dar lugar a graves deficiencias en el mantenimiento hematopoyético y en la respuesta al estrés ^9,23,24. El conocimiento de las células estromales hematopoyéticas es esencial para la comprensión de las enfermedades hematológicas ^<.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9647
C57Bl/6 mice	Jackson	664	Males or females, 8-12 weeks old
Calcein	Fisher Scientific	65-0853-78
Collagenase IV	Millipore Sigma	C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm	Fisher Scientific	08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Biolegend	422801
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Dnase I Solution	Thermo Fisher Scientific	90083	2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit	StemCell Technologies	19860
Fetal Bovine Serum	Gibco	A31605-01	Qualified One Shot
Human Fc Block	BD Biosciences	564220
Liberase TM	Millipore Sigma	5401127001	Research Grade
Medium 199	Gibco	12350
Mouse anti-human CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
Mouse anti-human CD45-BV77	Biolegend	304050
Mouse anti-human CD4-BV605	BD Biosciences	562658
Mouse anti-human CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
Mouse anti-human EpCam-BV421	Biolegend	324220
Protector RNase Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594	Biolegend	120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin	Biolegend	101204
Rat anti-mouse CD140a-APC	Fisher Scientific	17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737	BD Biosciences	612802
Rat anti-mouse CD31-BV421	Biolegend	102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin	Biolegend	100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin	Biolegend	109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin	Biolegend	103204
Rat anti-mouse CD51-PE	Biolegend	104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711	BD Biosciences	563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	Biolegend	108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin	Biolegend	108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin	Biolegend	116204
Rat anti-mouse Ter119-PE	Biolegend	116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7	Biolegend	116222
Stemxyme	Worthington Biochemical	LS004107