Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Özet

Tek hücre dizilemesi, hematopoietik organların stromasındaki heterojen hücre popülasyonlarının haritalanmasını sağlamıştır. Bu metodolojiler, kararlı durumda daha önce çözülmemiş heterojenliğin yanı sıra, dışsal stresler veya yaşlanma sırasında indüklenen hücre tipi temsilindeki değişiklikleri incelemek için bir mercek sağlar. Burada, murin ve insan timusundan yüksek kaliteli stromal hücre popülasyonlarının yanı sıra murin kemiği ve kemik iliğinden izolasyonu için adım adım protokoller sunuyoruz. Bu protokoller aracılığıyla izole edilen hücreler, yüksek kaliteli tek hücreli multiomik veri kümeleri oluşturmak için uygundur. Numune sindiriminin, hematopoietik soy tükenmesinin, FACS analizinin/sıralamasının etkileri ve bu faktörlerin tek hücreli dizileme ile uyumluluğu nasıl etkilediği burada tartışılmaktadır. Dizileme sonrası analizde başarılı ve verimsiz ayrışmayı ve aşağı akış stromal hücre verimlerini gösteren FACS profilleri örnekleri ile kullanıcılar için tanınabilir işaretçiler sağlanmaktadır. Stromal hücrelerin özel gereksinimlerini göz önünde bulundurmak, bu alandaki bilgiyi ilerletebilecek yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.

Giriş

Sağlıklı yetişkinde, de novo kan hücrelerinin üretimi kemik iliğinde ve timusta gerçekleşir. Bu bölgelerdeki stromal hücreler hematopoezin sürdürülmesi için gereklidir, ancak stroma dokunun %1'inden daha azını oluşturur 1,2,3,4. Bu nedenle, stroma'yı destekleyen saf hematopoez izolatlarının elde edilmesi, özellikle yüksek kalitede numuneler elde etmek için uygun işleme gerektiren tek hücreli multiomikler için önemli bir zorluk teşkil eder. Farklı sindirim kokteyllerinin bileşenleri, multiomik analizdeki belirli adımlara müdahale edebilir 5,6. Burada sunulan protokoller, kemik iliği ve timik dokulardan çok çeşitli stromal hücrelerin izolasyonunu detaylandırmaktadır.

Hem kemik iliği hem de timustaki stromal bileşenlerin bozulması, kan hücresi gelişiminde derin bozulmaya neden olur ve malignitelere neden olabilir 7,8,9. Stromayı destekleyen hematopoez, sitotoksik koşullandırma ve kemik iliği transplantasyonunu takiben hasar görür ve bu da hematopoietik kök ve progenitör hücreleri (HSPC'ler) sürdüren sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin salgılanmasının azalmasına neden olur2,10,11. Ayrıca, yaşlanma kemik iliği ve timus stromal hücrelerini etkiler ve muhtemelen yaşlı hematopoietik fenotiplere katkıda bulunur. Timus, yaşa bağlı geniş evrim geçiren ilk organdır. Yağ ve fibrotik doku, ergenliğin başlangıcında T hücreli destekleyici stromanın yerini almaya başlar12,13. Kemik iliğinde adiposit içeriği yaşla birlikte artar ve vasküler ve endosteal nişler önemli ölçüde yeniden şekillenir 14,15,16.

Hematopoezi destekleyici stromanın çoklu stres durumlarında ve hem insan hem de murin dokusunun timus durumunda çalışmasını sağlamak için, daha önce yayınlanmış sindirim protokollerinioptimize ettik 1,2,8,17,18. Bu protokoller, hücrelerin verimli ve tekrarlanabilir izolasyonunu sağlar ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve diğer multiomik türleri ile uyumludur.

Protokol

İnsan dokusu ile yapılan tüm çalışmalar, Massachusetts General Hospital Dahili İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri, Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu çalışma için 8-10 haftalık ve hem erkek hem de dişi C57Bl / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Murin timik dokusunun hazırlanması

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. % 2 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ile orta 199 (M199) (bkz.
    2. Murin ayrışma kokteyli: M199 +% 2 FBS'de 0.5 WU / mL Liberaz TM ve 6.3 U / mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. % 2 (a / h) Sığır serum albümini (BSA) ile M199.
      NOT: FBS içeren ortam, RNA kalitesini artırmak için BSA'ya geçirilebilir.
  2. Murin timus diseksiyonunu gerçekleştirin
    1. Fareyi CO2 boğulması ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve sırt üstü yatırın. % 70 etanol püskürterek göğsün üzerindeki kürkü ıslatın ve göğüs boşluğunu açmaya devam edin.
    2. Önce cerrahi makasla göğüs kafesinin hemen altında enine bir kesi yaparak timusu dikkatlice inceleyin. Farenin her iki yanındaki kaburgaları köprücük kemiğine kadar kesin. Daha sonra diyaframı göğüs duvarının serbest bırakılabilmesi için kesin. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları bir çift forseps ile kaldırın.
      1. Timus, boşluğun tepesinde, kalbin hemen üzerinde oturan beyaz, bilobular bir organdır. Timusu forseps ile tutun ve timusu yerinde tutan bağ dokusunu nazikçe kesin. Diseke timik dokuyu buz üzerinde M199 +% 2 FBS ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna koyun.
        NOT: Yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış fareler veya timik kusurları olan mutant suşlarla çalışırken, timus o kadar küçük olabilir ki, organı güvenilir bir şekilde çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu gerekir.
    3. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, künt uçlu forseps ve mikro yaylı makas kullanarak herhangi bir ekstratimik dokuyu çıkarın.
  3. Murin timik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (10 dakikalık artışlarla 30 dakika)
    1. Temizlenmiş timusu 15 mL'lik bir tüpün kapağına yerleştirin ve dokuyu steril cerrahi makasla ince ince kıyın.
      NOT: Sindirim için kullanılacak olan tüpün kapağındaki dokunun kıyılması, bir kaptan diğerine geçişe bağlı doku kaybını en aza indirir. Bu, yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış fareler veya timik kusurları olan mutant suşlarla çalışırken çok önemlidir. Bu ortamlardaki küçük timus boyutu, mümkün olan her yerde malzeme kaybını azaltma ihtiyacını gerektirir.
    2. 15 mL'lik tüpe 2 mL murin ayrışma kokteyli ekleyin, timus parçalarını içeren kapağı takın ve dokunun ayrışma kokteylinde yeniden süspanse edilmesini sağlamak için 5 kez ters çevirin.
    3. Sızıntıyı önlemek için, tüpün kapağını parafin filme sarın. Ardından tüpü 250 rpm çalkalama ile 37 ° C'lik bir su banyosuna yatay olarak yerleştirin. 10 dakika inkübe edin.
      NOT: Sindirim protokolünün başarısı, inkübasyonun 37 °C'de ve çalkalama ile yapılmasına bağlıdır. Açıklanan protokol, çalkalanan bir su banyosu kullanılarak optimize edilmiştir. Bu mevcut değilse, ısıtılmış bir ortamda ajitasyonu etkinleştiren diğer yaklaşımlar işe yarayabilir, ancak protokolün önce bu ayarlar için optimize edilmesini öneririz.
    4. 15 mL'lik tüpü bir rafa yerleştirin ve doku parçalarının oturmasına izin verin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 ml'lik bir tüpe geçirin.
    5. Toplam 3 tur sindirim için 2-4 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın. Doku, son inkübasyonun sonunda az ya da çok tamamen ayrışmalıdır.
    6. Toplanan hücre süspansiyonuna 20 mL M199 +% 2 FBS ekleyin. 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
    7. Süpernatanı çıkarın ve uygun bir M199 +% 2 FBS hacminde yeniden süspanse edin. Ardından hücre sayımına devam edin.
      NOT: M199 +% 2 FBS'nin yeniden süspanse edilmesi gereken hacim, timusun durumuna bağlı olacaktır. 6-10 haftalık fareler için, dokuyu 3-4 mL M199 +% 2 FBS içinde yeniden süspanse etmenizi öneririz. Bununla birlikte, yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış doku veya timik kusurlu mutant suşlar kullanan deneyler için, küçük timus boyutu 0.1-1 mL arasında değişen daha düşük hacimler gerektirecektir.
    8. Hücre süspansiyonunu %0,4 (a/h) tripan mavisi çözeltisinde 1:2 oranında seyrelterek hücreleri sayın. Hücreleri bir hemositometreye yükleyin ve parlak alan mikroskobu altında sayın. Mililitre başına canlı hücre sayısını belirlemek için boyanmamış hücreleri ve numune canlılığını değerlendirmek için mavi lekeli hücre sayısını sayın.
  4. Murin timik stromanın floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını gerçekleştirin
    1. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. 25 U / mL Koruyucu RNaz inhibitörü ile desteklenmiş M199 +% 2 FBS'de 5 x 107 hücre / mL konsantrasyonda hücreleri yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. 2 μg/mL konsantrasyonda murin Fc Bloğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri aşağıdaki antikorlarla boyayın: CD45-PE / Cy7 (4 μg / mL), Ter119-PE (4 μg / mL), CD31-BUV737 (2 μg / mL) ve EpCam-BV711 (2 μg / mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de 30 dakika boyunca.
    4. Numuneleri M199 + %2 BSA'da yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    5. DAPI (0.5 μg/mL) veya 7-AAD (1 μg/mL) gibi bir canlılık boyası içeren M199 + %2 BSA'daki süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse edin (bkz. Belirlenen protokolleri takip ederek timik stromal hücrelerin FACS izolasyonuna geçin19.

2. İnsan timik dokusunun hazırlanması

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. Orta 199 (M199) ve %2 (h/h) FBS.
    2. %1,5 (a/h) BSA ile M199.
    3. İnsan ayrışma kokteyli: M199 +% 1.5 BSA'da 1 mg / ml Kollajenaz IV ve 2 mg / mL Dispas ve 6.3 U / mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: İnsan timik dokusunun hazırlanmasındaki son sindirim adımı tripsin içerir. Bu nedenle, FBS tripsin aktivitesini inhibe edeceğinden, bu noktaya kadar olan tüm adımların BSA içeren tamponda gerçekleştirilmesi önemlidir.
  2. İnsan timik doku izolasyonu gerçekleştirin
    1. İnsan timusunu (daha önce yayınlanmış yöntem19'a göre toplanan) uygun bir hacimde M199 +% 1.5 BSA'ya yerleştirin ve işleme başlayana kadar buz üzerinde saklayın.
    2. İnsan timik dokusu ile çalışırken, işi bir doku kültürü başlığında gerçekleştirerek ve CDC yönergelerine göre standart önlemleri kullanarak potansiyel olarak bulaşıcıymış gibi ele alın20.
    3. Dokuyu 10 mL buz gibi M199 +% 1.5 BSA içeren 10 cm'lik bir Petri kabına koyun. Steril forseps ve makas kullanarak, organ çıkarılırken hasar gören ekstratimik yağ veya dokuyu dikkatlice temizleyin.
    4. Cerrahi makas ve bir çift forseps kullanarak, timusu 1 cm3 küp halinde kesin ve parçaları hafifçe aşağı itmek için 10 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın. Bu, gelişmekte olan timositlerin bir kısmını serbest bırakacak ve böylece sindirilecek doku hacmini azaltacaktır.
      NOT: Timosit gelişim aşamalarının daha sonraki analizine ihtiyaç duyulursa, salınan hematopoietik fraksiyonu kaydedin. Bununla birlikte, bu fraksiyonu enzimatik sindirim sırasında üretilen stromal hücre fraksiyonu ile birleştirmeyin. İki fraksiyonun bir araya getirilmesinin, hücre süspansiyonunda tıkanma oluşma riskini önemli ölçüde artırdığı ve sonuçta stromal hücrelerin verimini azalttığı gözlendi. Dokunun nazikçe ezilmesi sırasında çok az stromal hücre kaybolur.
  3. İnsan timik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (30 dakikalık artışlarla 90 dakika)
    1. Hafifçe ezilmiş timik doku parçalarının yaklaşık 5 mg'ını 50 mL'lik konik bir tüpün kapağına aktarın. Daha sonra steril cerrahi makas kullanarak dokuyu ince bir şekilde kesin.
    2. 8 mL insan ayrışma kokteylini 50 mL'lik tüpe pipetleyin, kıyılmış insan timik dokusunu içeren kapağı takın ve ardından tüm dokunun enzim kokteyli ile karıştığından emin olmak için tüpü 5 kez hafifçe ters çevirin.
    3. Sızıntıyı önlemek için tüpün kapağını parafin film ile sabitleyin. Tüpü 37 ° C'de 30 dakika boyunca sallanan (250 rpm) bir su banyosunda yatay olarak inkübe edin.
    4. 50 mL'lik tüpü bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarmadan ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerine yerleştirilmiş 50 ml'lik yeni bir tüpe geçirmeden önce insan timik doku parçalarının çökelmesine izin verin.
    5. İnsan ayrışma kokteyli ile toplam iki tur sindirim için 2.3.2-1.3.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. İkinci sindirim turu yapıldıktan sonra, kalan dokuya 8 mL daha insan ayrışma kokteyli ekleyin. Daha sonra 2 mL% 0.25 tripsin pipetleyin doku ayrışma tüpüne. 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin, 250 rpm'de çalkalayın.
      NOT: İnsan dokusu için sindirim süresinin en az 90 dakika olması kesinlikle önemlidir, çünkü daha kısa inkübasyon süreleri stromal hücre verimlerinin büyük ölçüde azalmasına neden olur.
    7. Son inkübasyon adımı yapıldıktan sonra, hücre süspansiyonunu ve kalan doku parçalarını, 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek önceki adımlarda toplanan süpernatan ile birleştirin. Tripsin reaksiyonunu kırmak için numuneye 3 mL FBS ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
    8. Adım 1.3'te açıklandığı gibi hücreleri saymaya devam edin.
  4. İnsan timik stromasının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasını gerçekleştirin
    1. İnsan timusunun hücre süspansiyonunu aşağı çevirin ve 25 U / mL Koruyucu RNaz inhibitörü ile desteklenmiş M199 +% 2 FBS'de 5 x 107 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirin.
    2. İnsan Fc Bloğu (5 μg/mL) ile 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL numune), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL numune), CD4-BV605 (5 μL/100 μL numune), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) ve EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) ile 4 ° C'de 30 dakika boyayın (bkz.
    4. Numuneleri M199 + %1,5 BSA'da yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    5. DAPI (0.5 μg/mL) veya 7-AAD (1 μg/mL) gibi bir canlılık boyası içeren M199 +% 1.5 BSA'daki süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse edin. Belirlenen protokolleri takip ederek timik stromal hücrelerin FACS izolasyonuna geçin19.

3. Murin kemiği ve kemik iliği dokusunun hazırlanması

NOT: Kemik ve kemik iliği fraksiyonları, stromal hücrelerin maksimum saflığını ve dokuların optimal ayrışmasını elde etmek için iki ayrı sindirim reaksiyonunda hazırlanır. Numuneler, sindirim adımlarından sonra tek bir stromal bölme olarak sıralanmak üzere bir araya getirilebilir.

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. %2 (h/h) FBS ile M199.
    2. Murin B&M (kemik ve ilik) ayrışma kokteyli: M199 +%2 FBS'de Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL ve 10 U/mL DNaz I ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: B&M ayrışma karışımını taze hazırlayın ve kullanana kadar karışımı buz üzerinde tutun.
    3. %0,5 (a/h) BSA ile M199.
    4. % 0,5 (a / h) BSA ile fosfat tamponlu salin (PBS).
    5. % 2 (a / h) Sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA ile M199.
      NOT: FBS içeren ortam, RNA kalitesini artırmak için BSA'ya geçirilebilir.
  2. Murin kemik iliği ayırma işlemi gerçekleştirin
    1. Fareyi CO2 boğulması ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Kürkü ıslatmak için% 70 etanol püskürtün.
    2. Femur, tibia, pelvis ve humerusu her iki taraftan dikkatlice çıkarın ve buz 21,22 üzerinde M199 +% 2 FBS içeren bir kuyuya yerleştirin.
    3. Kemiğe verilen zararı en aza indirmek ve periosteal tabakayı korumak için tüm kas, bağ ve kıkırdak dokusunu mendille çıkarın. Buz üzerinde M199 +% 2 FBS ile yeni bir kuyuya yerleştirin.
    4. Bir neşter kullanın ve epifizi çıkarmak için uzun kemiklerin büyüme plakalarını kesin ve buz üzerinde M199 +% 2 FBS içeren 10 cm'lik bir tabağa koyun.
    5. Kemik iliğini soluk beyaz olana kadar kemiklerden boşaltın. İliği buz üzerinde 15 mL'lik bir tüpe akıtmak için 28 G'lik bir iğne ve 10 mL M199 +% 2 FBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Kızarmış kemiği epifizle birlikte 10 cm'lik tabağa yerleştirin.
      NOT: Dokuların tamamen ayrılması için kemik iliğinin tamamen yıkanması, daha iyi numune hazırlanmasına neden olacaktır.
  3. Murin kemik iliği dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (10 dakikalık artışlarla toplam 30 dakika)
    1. 15 mL'lik tüpü, ilik tüpün dibine batana kadar buz üzerinde dik olarak bırakın. 10 mL M199 +% 2 FBS'yi pipetleyerek yavaşça çıkarın.
    2. 15 mL'lik tüpe 4 mL B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna (sallama yok) koyun.
    3. 5 dakika sonra tüpü üç kez ters çevirin ve tekrar su banyosuna yerleştirin.
    4. İlk 10 dakikadan sonra, peletin altta olduğundan emin olun ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 mL'lik bir tüpe süzerken süpernatanı toplayın. Kalan BM peletine 2 mL taze B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve tekrar su banyosuna koyun.
    5. Kalan kemik iliği parçalarını 1 mL'lik bir pipet kullanarak kuvvetli pipetleme ile ayırın. Elde edilen tüm hücre süspansiyonunu önceki adımlarda olduğu gibi aynı tüpte toplayın. Toplanan hücre süspansiyonuna 20 mL M199 +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA ekleyin.
      NOT: Adım 3.3.5'te, son sindirilen numuneden sonra eklenen tampon, daha fazla enzimatik aktiviteyi inhibe etmeye yardımcı olmak için EDTA içerir.
  4. Murin kemik iliği dokusunun hematopoietik hücre tükenmesini gerçekleştirin.
    1. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 ve CD3'ü hedefleyen biyotin antikorları (5 mg / mL) ile 500 μL PBS +% 0.5 BSA'da yeniden süspansiyon yapın (bkz. Kapaklı yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    2. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    3. Manyetik boncukları iyice vorteksleyin ve tüpe 25 μL manyetik boncuk ekleyin.
    4. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    5. Tüpü 2-3 dakika boyunca eşleşen mıknatısa yerleştirin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.
      NOT: Bu adımdan sonra kemik iliği bir havuzda toplanabilir veya kemik fraksiyonundan ayrı tutulabilir. Soy tükenmesi başarılı olursa, ortaya çıkan hücre süspansiyonu kırmızı hücrelerden yoksun olmalıdır.
  5. Murin kemik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
    1. 50 mL'lik bir tüpün düz kapak ucu ile 10 cm'lik tabakta kemikleri daha küçük parçalara ayırın. Filtrenin içindeki kemik parçalarını izole etmek için süpernatanı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
      NOT: Alternatif olarak, kemik parçalanması için bir havan ve havan tokmağı kullanılabilir. Bununla birlikte, bu seçenek, kemik kırılmak yerine topraklandığında daha fazla döküntü ve daha düşük stromal hücre canlılığı üretme eğilimindedir. Stroma hücreleri hala kemiğe ve kemiğe yapışıktır ve hematopoietik hücreleri içeren süpernatan atılmalıdır.
    2. Hücre süzgecindeki kemik parçalarını kesmek için makas kullanın. Bu, daha verimli bir enzimatik ayrışma için yüzey alanını artıracaktır. Kemiği 5 mL M199 +% 2 FBS ile yıkayın.
    3. Kemik fraksiyonunu 5 mL murin B&M ayrışmasına yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeni bir 50 mL tüpte karıştırın.
    4. Sızıntıyı önlemek için, tüpün kapağını parafin filme sarın. Ardından tüpü yatay olarak 37 °C'lik bir su banyosuna 120 rpm ile 30 dakika çalkalayarak yerleştirin.
    5. Sindirimden sonra, 25 mL M199 +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA ekleyin ve stromal hücreleri içeren süpernatanı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 ml'lik bir tüpe süzün.
      NOT: Ortaya çıkan kemik parçalarının sindirim yoluyla gözle görülür şekilde azaldığını kontrol edin. Adım 3.5.5'te, son sindirilen numuneden sonra eklenen tampon, daha fazla enzimatik aktiviteyi inhibe etmeye yardımcı olmak için EDTA içerir.
  6. Murin kemiği ve kemik iliği stromasının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasını gerçekleştirin.
    1. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    2. PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'da 10 μg / mL konsantrasyonda murin Fc Bloğunda yeniden süspansiyon yapın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri (10 milyon hücre / 100 μL toplam boyama hacmine kadar) aşağıdaki antikorlarla boyayın: CD45-PE / Cy7 (1 μg / mL), Ter119-PE / Cy7 (1 μg / mL), CD31-BV421 (0.66 μg / mL), CD140a-APC (2 μg / mL), Sca1-AF700 (0.66 μg / mL), CD51-PE (2 μg / mL), CD105-PE / göz kamaştırıcı (2 μg / mL) (bkz.
    4. Calcein-'yi oda sıcaklığına dengelemeye bırakın ve 50 μL DMSO'da yeniden süspanse edin. Her kullanım için taze olarak hazırlayın. Yeniden süspansiyondan sonra oda sıcaklığında tutun. Antikor boyama kokteylinde zaten yeniden süspanse edilmiş olan numuneye (20 μg / mL) eklemeden önce kalseini PBS (0.1 mg / mL) içinde önceden seyreltin ve karanlıkta 4 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.
    5. Numuneleri PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'da yıkayın ve 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı çıkarın ve PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'daki hücreleri yeniden süspanse edin. Belirlenen protokolleri takip ederek kemik ve kemik iliği stromal hücrelerinin FACS izolasyonuna geçin19.

Sonuçlar

Bu protokoller, akış sitometrik analizi için uygun timus ve kemik iliğinden tekrarlanabilir stromal hücre çeşitlerinin yanı sıra scRNA dizilemesi gibi tek hücreli multiomikler verir. Murin timik dokusu, kemik iliği naklinden önce gelen sitotoksik koşullanma veya doğal yaşlanma süreci gibi stres faktörlerine yanıt olarak önemli bir yeniden şekillenme geçirir. Sonuç olarak, timik hücresellik bu ayarların her ikisinde de büyük ölçüde azalır (Şekil 1A). 8 haftalık...

Tartışmalar

Hematopoetik organlardaki stromal hücreler normal kan üretimi için kritik öneme sahiptir ve hematopoietik stroma bozulmaları hematopoietik bakımda ve strese yanıtta ciddi bozulmalara neden olabilir 9,23,24. Hematopoietik stromal hücrelere ilişkin içgörü, hematolojik hastalıklarıanlamak 7,9,10,24 ve bunlarla savaşmak için terapötikler geliştirme yeteneğ...

Açıklamalar

D.T.S., Agios Therapeutics ve Editas Medicines'ın yöneticisi ve hissedarıdır; Magenta Therapeutics ve LifeVault Bio'nun kurucusu, direktörü, hissedarı ve bilimsel danışma kurulu üyesi, Fate Therapeutics ve Garuda Therapeutics'in hissedarı ve kurucusu ve Clear Creek Bio'nun direktörü, kurucusu ve hissedarı, FOG Pharma, Inzen Therapeutics ve VCanBio'nun danışmanı ve Sumitomo Dianippon'dan sponsorlu araştırma fonu alıcısı. D.T.S ve K.G, patent US20220143099A1 mucitleridir.

Teşekkürler

Massachusetts General Hospital'daki HSCI-CRM Akış Sitometrisi tesisi ve Harvard Üniversitesi'ndeki Bauer Core Tesisi tarafından uzman teknik yardımla desteklendik. T.K ve K. G, İsveç Araştırma Konseyi ve C.M. Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklendi. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizindeki yardımları için Sergey Isaev ve I-Hsiu Lee'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Males or females, 8-12 weeks old
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)Biolegend422801
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

Referanslar

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
  21. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  22. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  23. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  24. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  25. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  26. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
  27. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Stromal H crelerHematopoetik OrganlarTek H cre DizilemeH cre zolasyonuTimusKemikKemik li iFACSMultiomikH cre Ayr mas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır