Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Özet

Tek hücre dizilemesi, hematopoietik organların stromasındaki heterojen hücre popülasyonlarının haritalanmasını sağlamıştır. Bu metodolojiler, kararlı durumda daha önce çözülmemiş heterojenliğin yanı sıra, dışsal stresler veya yaşlanma sırasında indüklenen hücre tipi temsilindeki değişiklikleri incelemek için bir mercek sağlar. Burada, murin ve insan timusundan yüksek kaliteli stromal hücre popülasyonlarının yanı sıra murin kemiği ve kemik iliğinden izolasyonu için adım adım protokoller sunuyoruz. Bu protokoller aracılığıyla izole edilen hücreler, yüksek kaliteli tek hücreli multiomik veri kümeleri oluşturmak için uygundur. Numune sindiriminin, hematopoietik soy tükenmesinin, FACS analizinin/sıralamasının etkileri ve bu faktörlerin tek hücreli dizileme ile uyumluluğu nasıl etkilediği burada tartışılmaktadır. Dizileme sonrası analizde başarılı ve verimsiz ayrışmayı ve aşağı akış stromal hücre verimlerini gösteren FACS profilleri örnekleri ile kullanıcılar için tanınabilir işaretçiler sağlanmaktadır. Stromal hücrelerin özel gereksinimlerini göz önünde bulundurmak, bu alandaki bilgiyi ilerletebilecek yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.

Giriş

Sağlıklı yetişkinde, de novo kan hücrelerinin üretimi kemik iliğinde ve timusta gerçekleşir. Bu bölgelerdeki stromal hücreler hematopoezin sürdürülmesi için gereklidir, ancak stroma dokunun %1'inden daha azını oluşturur 1,2,3,4. Bu nedenle, stroma'yı destekleyen saf hematopoez izolatlarının elde edilmesi, özellikle yüksek kalitede numuneler elde etmek için uygun işleme gerektiren tek hücreli multiomikler için önemli bir zorluk teşkil eder. Farklı sindirim kokteyllerinin bileşenleri, multiomik analizdeki belirli adımlara müdahale edebilir

Protokol

İnsan dokusu ile yapılan tüm çalışmalar, Massachusetts General Hospital Dahili İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri, Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu çalışma için 8-10 haftalık ve hem erkek hem de dişi C57Bl / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Murin timik dokusunun hazırlanması

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. % 2 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ile orta 199 (M199) (bkz.

Temsili Sonuçlar

Bu protokoller, akış sitometrik analizi için uygun timus ve kemik iliğinden tekrarlanabilir stromal hücre çeşitlerinin yanı sıra scRNA dizilemesi gibi tek hücreli multiomikler verir. Murin timik dokusu, kemik iliği naklinden önce gelen sitotoksik koşullanma veya doğal yaşlanma süreci gibi stres faktörlerine yanıt olarak önemli bir yeniden şekillenme geçirir. Sonuç olarak, timik hücresellik bu ayarların her ikisinde de büyük ölçüde azalır (Şekil 1A). 8 haftalık.......

Tartışmalar

Hematopoetik organlardaki stromal hücreler normal kan üretimi için kritik öneme sahiptir ve hematopoietik stroma bozulmaları hematopoietik bakımda ve strese yanıtta ciddi bozulmalara neden olabilir 9,23,24. Hematopoietik stromal hücrelere ilişkin içgörü, hematolojik hastalıklarıanlamak 7,9,10,24 ve bunlarla savaşmak için terapötikler geliştirme yeteneğ.......

Açıklamalar

D.T.S., Agios Therapeutics ve Editas Medicines'ın yöneticisi ve hissedarıdır; Magenta Therapeutics ve LifeVault Bio'nun kurucusu, direktörü, hissedarı ve bilimsel danışma kurulu üyesi, Fate Therapeutics ve Garuda Therapeutics'in hissedarı ve kurucusu ve Clear Creek Bio'nun direktörü, kurucusu ve hissedarı, FOG Pharma, Inzen Therapeutics ve VCanBio'nun danışmanı ve Sumitomo Dianippon'dan sponsorlu araştırma fonu alıcısı. D.T.S ve K.G, patent US20220143099A1 mucitleridir.

Teşekkürler

Massachusetts General Hospital'daki HSCI-CRM Akış Sitometrisi tesisi ve Harvard Üniversitesi'ndeki Bauer Core Tesisi tarafından uzman teknik yardımla desteklendik. T.K ve K. G, İsveç Araştırma Konseyi ve C.M. Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklendi. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizindeki yardımları için Sergey Isaev ve I-Hsiu Lee'ye teşekkür ederiz.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Males or females, 8-12 weeks old
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)Biolegend422801
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

Referanslar

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induc....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Stromal H crelerHematopoetik OrganlarTek H cre DizilemeH cre zolasyonuTimusKemikKemik li iFACSMultiomikH cre Ayr mas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır