Detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Resumen

La detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real es un método sensible y preciso para diagnosticar y controlar la infección por el VHB. Aquí, presentamos un protocolo para la detección de ADN del VHB y la medición de la carga viral de una muestra.

Resumen

El virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de enfermedad hepática en todo el mundo. Puede provocar infecciones agudas o crónicas, lo que hace que las personas sean muy susceptibles a la cirrosis mortal y al cáncer de hígado. La detección y cuantificación precisas del ADN del VHB en la sangre son esenciales para el diagnóstico y el seguimiento de la infección por el VHB. El método más común para detectar el ADN del VHB es la PCR en tiempo real, que se puede utilizar para detectar el virus y evaluar la carga viral para monitorear la respuesta a la terapia antiviral. Aquí, describimos un protocolo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD. El kit utiliza cebadores y sondas que se dirigen a la región central altamente conservada del genoma del VHB y pueden cuantificar con precisión todos los genotipos del VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I y J). El kit también incluye un control interno endógeno para monitorizar la posible inhibición de la PCR. Este ensayo tiene una duración de 40 ciclos y su punto de corte es de 38 Ct. Para la cuantificación del ADN del VHB en muestras clínicas, se proporciona un conjunto de 5 patrones de cuantificación con el kit. Los patrones contienen concentraciones conocidas de ADN específico del VHB que están calibradas con respecto al^4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Los patrones se utilizan para validar la funcionalidad de la amplificación de ADN específica del VHB y para generar una curva estándar, que permite la cuantificación del ADN del VHB en una muestra. El ADN del VHB tan bajo como 2,5 UI/ml se detectó utilizando el kit de PCR. La alta sensibilidad y reproducibilidad del kit lo convierten en una poderosa herramienta en los laboratorios clínicos, ayudando a los profesionales de la salud a diagnosticar y manejar eficazmente las infecciones por VHB.

Introducción

El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN parcialmente bicatenario del género Orthohepadnavirus y de la familia Hepadnaviridae ¹. Puede desencadenar una infección crónica que persiste durante toda la vida, lo que puede conducir a cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular ^2,3,4. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que en 2019 una población de 296 millones de personas vivía con una infección crónica por hepatitis B, y 1,5 millones de personas se infectaban cada año⁵.

La identificación y medición del ADN del VHB en muestras de suero o plasma sirve como un método valioso para detectar individuos con una infección continua por hepatitis B, evaluar la eficacia del tratamiento antiviral y predecir la probabilidad de éxito del tratamiento 6,7,8,9,10,11. La carga viral alta se asocia con un mayor riesgo de progresión de la enfermedad hepática, incluida la cirrosis y el cáncer de hígado^12,13. Por lo tanto, la medición precisa de la carga viral es crucial para rastrear la progresión de la infección por VHB e informar las decisiones sobre el tratamiento.

Los ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real tienen mayor sensibilidad, un rango dinámico más amplio y una cuantificación más precisa del ADN del VHB que las técnicas de PCR convencionales 14,15,16,17. En el mercado existen varios kits comerciales de diagnóstico molecular basados en PCR en tiempo real para la cuantificación del ADN del VHB en muestras de suero o plasma. Aquí, describimos un flujo de trabajo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD disponible comercialmente. El kit es un ensayo^18,19 ampliamente utilizado, de bajo costo, pero altamente sensible, y sus características de rendimiento son comparables con otros kits con marcado CE disponibles ^{comercialmente18}. Además de la amplificación de la región diana del VHB, también se incluye en el kit un gen de control interno endógeno para verificar la calidad de las muestras, la calidad del ADN extraído, la amplificación por PCR y la posible inhibición por PCR.

Protocolo

En este estudio no participaron participantes humanos ni muestras clínicas. El único material biológico utilizado fue el^4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Esta norma es un material de referencia disponible públicamente que no contiene ninguna información personal ni datos identificables. Por lo tanto, no se requirió aprobación ética para este estudio.

1. Extracción de ADN

1. Extraer el ADN viral de una muestra de suero o plasma humano. Almacenar el ADN extraído a -20 °C hasta su uso posterior en PCR.
   NOTA: El volumen recomendado de suero o plasma para la extracción de ADN es de 500 μL y el volumen de elución es de 50 μL. En este estudio, el ADN viral se extrajo utilizando un kit de extracción de ácido nucleico viral (Tabla de Materiales).

2. PCR en tiempo real

1. Descongelar todos los reactivos (Tabla 1) del kit de PCR en tiempo real a temperatura ambiente (RT; 15-25 °C) antes de iniciar la PCR. Cuando se descongelen, mezcle los componentes mediante vórtice de pulsos durante 10 s a una velocidad moderada y centrifugue a 8.000 × g durante 15 s a RT. Mantenga todos los componentes descongelados en un bloque de enfriamiento.
2. Preparación de la reacción
   1. Prepare una mezcla de PCR de acuerdo con la Tabla 2. Calcule el volumen de los reactivos que se van a añadir en función del número de muestras, los patrones y la ausencia de control de plantilla.
      NOTA: Al preparar la mezcla de PCR, se debe agregar al menos un 10% de volumen adicional de cada reactivo (por ejemplo, si se requieren 10 reacciones, calcule para 11 reacciones).
   2. Pipetear 15 μL de la mezcla de PCR preparada anteriormente en cada tubo de PCR. A continuación, añadir 15 μL del ADN de la muestra extraída. Agregue 15 μL de al menos uno de los patrones para el VHB (Estándar 1-5 del VHB) como control positivo (PC) para detectar el ADN del VHB y 15 μL de agua libre de nucleasas de grado PCR como control negativo (NC). Para generar una curva estándar necesaria para la cuantificación del ADN del VHB, utilice los 5 estándares de cuantificación suministrados con el kit (Estándar 1-5 del VHB) para cada ejecución de PCR.
   3. Cierre los tubos, mezcle los componentes mediante vórtice de pulso durante 10 s a una velocidad moderada y centrifugue a 8.000 × g durante 15 s a RT antes de pasar al termociclador. Asegúrese de que no haya burbujas en la mezcla de reacción, ya que puede interferir con la detección de fluorescencia.
3. Configuración del programa
   1. Programe el termociclador utilizando las condiciones de ciclo recomendadas en la Tabla 3.
4. Selección de canal/fluoróforo
   1. Seleccione los colorantes fluorescentes para las plataformas de PCR en tiempo real de uso común, como se menciona en la Tabla 4.
5. Análisis de datos
   1. Una vez completada la ejecución, analice el gráfico de amplificación a escala lineal.
   2. Ajuste de umbral
      1. Establezca el umbral dentro de la fase exponencial de una reacción de PCR. Los valores umbral recomendados para el kit se mencionan en la Tabla 5. Sea coherente con la configuración del umbral. Una vez que se determina el umbral óptimo para el ensayo, utilícelo de manera consistente para todas las muestras de una máquina de PCR en particular. Esto ayudará a garantizar que los resultados sean precisos y reproducibles.
         NOTA: Si el umbral se establece demasiado bajo, la señal puede estar por debajo del nivel de ruido y el valor de Ct no será confiable. Si el umbral se establece demasiado alto, la señal puede estar en la fase de meseta de la reacción, donde la amplificación no es tan eficiente, y el valor de Ct puede ser inexacto.
   3. Atajo
      1. Ejecute el kit durante 40 ciclos de amplificación. No considere ninguna amplificación más allá de 38 ciclos para cualquier interpretación.
   4. Análisis cualitativo de resultados
      1. Utilice el kit para la detección cualitativa del ADN del VHB. Utilice el estándar 2 como PC con valores esperados de Ct de 20 ± 2 para el VHB y de 24 ± 3 para el CI.
      2. Asegúrese de que ningún control de plantilla (NTC) no muestre ninguna amplificación para los objetivos de VHB y control interno (IC). Si se produce una reacción de amplificación en la reacción NTC, es posible que se haya producido contaminación de la muestra.
      3. Dado que el punto de corte del ensayo es 38, considere cualquier amplificación antes de 38 Ct para la diana del VHB como una muestra positiva para el VHB. Cuando todos los controles cumplan con los requisitos antes mencionados, considere una muestra siguiendo las interpretaciones mencionadas en la Tabla 6.
   5. Análisis cuantitativo de resultados
      1. Utilice el conjunto de 5 patrones de cuantificación de concentraciones conocidas para el ADN específico del VHB que están calibrados con respecto al 4º estándar internacional de la OMS para el ADN del VHB para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT)²⁰ (Tabla 7).
      2. Emplee estos estándares para generar una curva estándar. Utilice la curva estándar para cuantificar el ADN del VHB de una muestra desconocida.
         NOTA: El software de PCR en tiempo real generará una curva patrón utilizando los valores de Ct obtenidos para los objetivos de VHB de los 5 patrones y sus correspondientes concentraciones en unidades internacionales por microlitro (UI/μL).
      3. Solo interprete los valores para muestras desconocidas si la pendiente de los patrones se encuentra entre -3.1 y -3.6, el valor de R² está entre 0.99 y 1.0, la eficiencia de la PCR está entre el 90% y el 110% (0.9-1.1) y no hay amplificación en el control negativo.
      4. El software calculará la concentración de cada muestra positiva para el VHB en unidades internacionales por microlitro (UI/μL). Para calcular la carga viral (conversión de UI/μL a unidades internacionales por mililitro [UI/mL]), utilice la siguiente ecuación:
         Resultado (UI/mL) = (Resultado [UI/μL] x Volumen de elución [μL])/ Volumen de la muestra (mL)
         NOTA: El^4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB, código NIBSC 10/266, se extrajo para la purificación del ADN viral de 0,5 ml de plasma, se eluyó el ADN viral purificado en 50 μl de tampón de elución y se utilizó con el kit de PCR como muestra de referencia junto con los 5 estándares del VHB y NTC. La carga viral del VHB de la muestra de referencia (código NIBSC 10/266) se calculó como (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65,900 UI/mL.

Resultados

En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático del flujo de trabajo para detectar y cuantificar el ADN del VHB a partir de plasma/suero humano. En la Figura 2 se muestra un gráfico de amplificación del Estándar 2 (utilizado como PC) y NTC tanto para el VHB como para el CI. La Figura 3 muestra las curvas de amplificación para una muestra positiva para el VHB, una muestra negativa para el VHB y una muestra con inhibición por ...

Discusión

Al código NIBSC 10/266 se le ha asignado una unidad de 9,55.000 UI/mL cuando se reconstituye en 0,5 mL de agua libre de nucleasa, según la información del proveedor²¹. Esto puede considerarse una muestra positiva para el VHB de alta carga. La carga viral del VHB determinada por el kit de carga viral utilizado en este estudio fue de 6,65,900 UI/mL (Figura 4). Como la eficiencia de extracción de ADN de cualquier kit de extracción de ADN no es del 100%, a menudo se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198