Rilevamento e quantificazione in tempo reale del DNA del virus dell'epatite B basato sulla reazione a catena della polimerasi

Riepilogo

Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B (HBV) basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale sono un metodo sensibile e accurato per diagnosticare e monitorare l'infezione da HBV. Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento del DNA dell'HBV e la misurazione della carica virale di un campione.

Abstract

Il virus dell'epatite B (HBV) è una causa significativa di malattie del fegato in tutto il mondo. Può portare a infezioni acute o croniche, rendendo gli individui altamente suscettibili alla cirrosi fatale e al cancro al fegato. Il rilevamento e la quantificazione accurati del DNA dell'HBV nel sangue sono essenziali per la diagnosi e il monitoraggio dell'infezione da HBV. Il metodo più comune per rilevare il DNA dell'HBV è la PCR in tempo reale, che può essere utilizzata per rilevare il virus e valutare la carica virale per monitorare la risposta alla terapia antivirale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione e la quantificazione del DNA dell'HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato su PCR in tempo reale marcato IVD. Il kit utilizza primer e sonde che mirano alla regione centrale altamente conservata del genoma dell'HBV e possono quantificare con precisione tutti i genotipi di HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). Il kit include anche un controllo interno endogeno per monitorare l'eventuale inibizione della PCR. Questo test viene eseguito per 40 cicli e il suo cutoff è di 38 Ct. Per la quantificazione del DNA dell'HBV nei campioni clinici, con il kit viene fornito un set di 5 standard di quantificazione. Gli standard contengono concentrazioni note di DNA specifico per l'HBV che sono calibrate rispetto al 4^° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Gli standard sono utilizzati per convalidare la funzionalità dell'amplificazione del DNA HBV-specifico e per generare una curva standard, consentendo la quantificazione del DNA dell'HBV in un campione. Il DNA dell'HBV fino a 2,5 UI/mL è stato rilevato utilizzando il kit PCR. L'elevata sensibilità e riproducibilità del kit lo rendono un potente strumento nei laboratori clinici, aiutando gli operatori sanitari a diagnosticare e gestire efficacemente le infezioni da HBV.

Introduzione

Il virus dell'epatite B (HBV) è un virus a DNA parzialmente a doppio filamento del genere Orthohepadnavirus e della famiglia Hepadnaviridae ¹. Può scatenare un'infezione cronica che persiste per tutta la vita, portando potenzialmente a cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare ^2,3,4. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2019 una popolazione stimata di 296 milioni di persone conviveva con l'infezione cronica da epatite B e 1,5 milioni di persone venivano infettate ogni anno⁵.

L'identificazione e la misurazione del DNA dell'HBV in campioni di siero o plasma sono un metodo prezioso per rilevare gli individui con un'infezione da epatite B in corso, valutare l'efficacia del trattamento antivirale e prevedere la probabilità di successo del trattamento 6,7,8,9,10,11. Un'elevata carica virale è associata a un aumentato rischio di progressione della malattia epatica, tra cui cirrosi e cancro al fegato^12,13. Pertanto, la misurazione precisa della carica virale è fondamentale per monitorare la progressione dell'infezione da HBV e prendere decisioni informate in merito al trattamento.

I saggi quantitativi di PCR in tempo reale hanno una maggiore sensibilità, un intervallo dinamico più ampio e una quantificazione più accurata del DNA dell'HBV rispetto alle tecniche di PCR convenzionali 14,15,16,17. Sul mercato sono disponibili diversi kit diagnostici molecolari commerciali basati sulla PCR in tempo reale per la quantificazione del DNA dell'HBV in campioni di siero o plasma. In questo articolo, descriviamo un flusso di lavoro dettagliato per il rilevamento e la quantificazione del DNA dell'HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato sulla PCR in tempo reale disponibile in commercio e marcato IVD. Il kit è un test^18,19 ampiamente utilizzato, a basso costo, ma altamente sensibile, e le sue caratteristiche prestazionali sono paragonabili a quelle di altri kit con marchio CE disponibili in ^commercio18. Oltre all'amplificazione della regione bersaglio dell'HBV, nel kit è incluso anche un gene di controllo interno endogeno per verificare la qualità dei campioni, la qualità del DNA estratto, l'amplificazione della PCR e l'eventuale inibizione della PCR.

Protocollo

Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani o campioni clinici. L'unico materiale biologico utilizzato è stato il 4^° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Questo standard è un materiale di riferimento disponibile al pubblico che non contiene informazioni personali o dati identificabili. Pertanto, non è stata richiesta alcuna approvazione etica per questo studio.

1. Estrazione del DNA

1. Estrarre il DNA virale da un campione di siero o plasma umano. Conservare il DNA estratto a -20 °C fino al successivo utilizzo in PCR.
   NOTA: Il volume raccomandato di siero o plasma per l'estrazione del DNA è di 500 μL e il volume di eluizione è di 50 μL. In questo studio, il DNA virale è stato estratto utilizzando un kit di estrazione dell'acido nucleico virale (Table of Materials).

2. PCR in tempo reale

1. Scongelare tutti i reagenti (Tabella 1) del kit di PCR in tempo reale a temperatura ambiente (RT; 15-25 °C) prima di iniziare la PCR. Una volta scongelati, miscelare i componenti mediante vortice a impulsi per 10 s a velocità moderata e centrifugare a 8.000 × g per 15 s a RT. Tenere tutti i componenti scongelati su un blocco di raffreddamento.
2. Preparazione della reazione
   1. Preparare una miscela PCR secondo la Tabella 2. Calcolare il volume dei reagenti da aggiungere in base al numero di campioni, agli standard e all'assenza di controllo del modello.
      NOTA: Quando si prepara la miscela PCR, è necessario aggiungere almeno il 10% in più di volume di ciascun reagente (ad esempio, se sono necessarie 10 reazioni, calcolare per 11 reazioni).
   2. Pipettare 15 μL della miscela PCR preparata sopra in ciascuna provetta PCR. Quindi, aggiungere 15 μL del DNA del campione estratto. Aggiungere 15 μL di almeno uno degli standard per l'HBV (HBV Standard 1-5) come controllo positivo (PC) per la rilevazione del DNA dell'HBV e 15 μL di acqua priva di nucleasi di grado PCR come controllo negativo (NC). Per generare una curva standard richiesta per la quantificazione del DNA dell'HBV, utilizzare tutti e 5 gli standard di quantificazione forniti con il kit (HBV Standard 1-5) per ogni esecuzione della PCR.
   3. Chiudere le provette, miscelare i componenti mediante vortice a impulsi per 10 s a velocità moderata e centrifugare a 8.000 × g per 15 s a RT prima di procedere al termociclatore. Assicurarsi che non vi siano bolle nella miscela di reazione, in quanto potrebbe interferire con il rilevamento della fluorescenza.
3. Impostazione del programma
   1. Programmare il termociclatore utilizzando le condizioni di ciclo consigliate nella Tabella 3.
4. Selezione canale/fluoroforo
   1. Selezionare i coloranti fluorescenti per le piattaforme di PCR in tempo reale comunemente utilizzate, come indicato nella Tabella 4.
5. Analisi dei dati
   1. Al termine dell'esecuzione, analizzare il grafico di amplificazione su scala lineare.
   2. Impostazione della soglia
      1. Impostare la soglia all'interno della fase esponenziale di una reazione PCR. I valori di soglia consigliati per il kit sono indicati nella Tabella 5. Essere coerenti con l'impostazione della soglia. Una volta determinata la soglia ottimale per il test, utilizzarla in modo coerente per tutti i campioni di una particolare macchina PCR. Ciò contribuirà a garantire che i risultati siano accurati e riproducibili.
         NOTA: Se la soglia è impostata su un valore troppo basso, il segnale potrebbe essere inferiore al livello di rumore e il valore Ct sarà inaffidabile. Se la soglia è impostata su un valore troppo alto, il segnale potrebbe trovarsi nella fase di plateau della reazione, dove l'amplificazione non è altrettanto efficiente e il valore Ct potrebbe essere impreciso.
   3. Taglio
      1. Eseguire il kit per 40 cicli di amplificazione. Non considerare alcuna amplificazione oltre i 38 cicli per qualsiasi interpretazione.
   4. Analisi qualitativa dei risultati
      1. Utilizzare il kit per la rilevazione qualitativa del DNA dell'HBV. Utilizzare lo standard 2 come PC con valori di Ct attesi a 20 ± 2 per HBV e 24 ± 3 per IC.
      2. Assicurarsi che nessun controllo del modello (NTC) non presenti alcuna amplificazione sia per l'HBV che per i target di controllo interno (IC). Se si verifica una reazione di amplificazione nella reazione NTC, è possibile che si sia verificata una contaminazione del campione.
      3. Poiché il cutoff del test è 38, considerare qualsiasi amplificazione prima di 38 Ct per il target dell'HBV come un campione HBV-positivo. Quando tutti i controlli soddisfano i requisiti di cui sopra, prendere in considerazione un campione secondo le interpretazioni di cui alla tabella 6.
   5. Analisi quantitativa dei risultati
      1. Utilizzare l'insieme di 5 standard di quantificazione delle concentrazioni note per il DNA specifico dell'HBV calibrati rispetto al 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici (NAT)²⁰ (Tabella 7).
      2. Utilizzate questi standard per generare una curva standard. Utilizzare la curva standard per quantificare il DNA dell'HBV di un campione sconosciuto.
         NOTA: Il software di PCR in tempo reale genererà una curva standard utilizzando i valori Ct ottenuti per i target HBV di tutti e 5 gli standard e le loro corrispondenti concentrazioni in unità internazionali per microlitro (UI/μL).
      3. Interpretare i valori per i campioni sconosciuti solo se la pendenza degli standard è compresa tra -3,1 e -3,6, il valore di R² è compreso tra 0,99 e 1,0, l'efficienza della PCR è compresa tra il 90% e il 110% (0,9-1,1) e non vi è amplificazione nel controllo negativo.
      4. Il software calcolerà la concentrazione di ciascun campione HBV-positivo in unità internazionali per microlitro (UI/μL). Per calcolare la carica virale (conversione di UI/μL in unità internazionali per millilitro [UI/mL]), utilizzare la seguente equazione:
         Risultato (UI/mL) = (Risultato [UI/μL] x Volume di eluizione [μL])/ Volume del campione (mL)
         NOTA: Il 4^° standard internazionale dell'OMS per il DNA HBV, codice NIBSC 10/266, è stato estratto per la purificazione del DNA virale da 0,5 mL di plasma, ha eluito il DNA virale purificato in 50 μL di tampone di eluizione e utilizzato con il kit PCR come campione di riferimento insieme ai 5 standard HBV e NTC. La carica virale dell'HBV del campione di riferimento (codice NIBSC 10/266) è stata calcolata come (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65,900 UI/mL.

Risultati

Nella Figura 1 è mostrato un diagramma schematico del flusso di lavoro per rilevare e quantificare il DNA dell'HBV dal plasma/siero umano. Nella Figura 2 è mostrato un grafico di amplificazione dello Standard 2 (utilizzato come PC) e NTC sia per HBV che per IC. La Figura 3 mostra le curve di amplificazione per un campione HBV-positivo, un campione HBV-negativo e un campione con inibizione della PCR. La curva di amplificazione, il ...

Discussione

Al codice NIBSC 10/266 è stata assegnata un'unità di 9,55,000 UI/mL quando ricostituito in 0,5 mL di acqua priva di nucleasi secondo le informazioni del fornitore²¹. Questo può essere considerato un campione positivo all'HBV ad alto carico. La carica virale dell'HBV determinata dal kit di carica virale utilizzato in questo studio è stata di 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Poiché l'efficienza di estrazione del DNA di qualsiasi kit di estrazione del DNA non è del 100%,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198