Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В в режиме реального времени на основе полимеразной цепной реакции

Резюме

Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени является чувствительным и точным методом диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Здесь мы представляем протокол обнаружения ДНК ВГВ и измерения вирусной нагрузки в образце.

Аннотация

Вирус гепатита В (ВГВ) является одной из основных причин заболеваний печени во всем мире. Это может привести к острым или хроническим инфекциям, что делает людей очень восприимчивыми к смертельному циррозу и раку печени. Точное обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ в крови имеют важное значение для диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Наиболее распространенным методом обнаружения ДНК ВГВ является ПЦР в реальном времени, которая может быть использована для обнаружения вируса и оценки вирусной нагрузки для мониторинга ответа на противовирусную терапию. В этой статье мы опишем подробный протокол обнаружения и количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке или плазме крови человека с использованием набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. В наборе используются праймеры и зонды, которые нацелены на высококонсервативную основную область генома ВГВ и могут точно количественно определить все генотипы ВГВ (A, B, C, D, E, F, G, H, I и J). Набор также включает в себя эндогенный внутренний контроль для мониторинга возможного ингибирования ПЦР. Этот анализ рассчитан на 40 циклов, а его пороговое значение составляет 38 Ct. Для количественного определения ДНК HBV в клинических образцах в комплекте с набором поставляется набор из 5 стандартов количественного определения. Стандарты содержат известные концентрации ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с^4-м Международным стандартом ВОЗ по ДНК ВГВ для теста на нуклеиновые кислоты (код NIBSC 10/266). Стандарты используются для проверки функциональности амплификации ДНК, специфичной для ВГВ, и для создания стандартной кривой, позволяющей количественно определить ДНК ВГВ в образце. С помощью набора для ПЦР была выявлена ДНК вируса гепатита В до 2,5 МЕ/мл. Высокая чувствительность и воспроизводимость набора делают его мощным инструментом в клинических лабораториях, помогая медицинским работникам эффективно диагностировать и лечить инфекции ВГВ.

Введение

Вирус гепатита В (HBV) представляет собой частично двухцепочечный ДНК-вирус из рода Orthohepadnavirus и семейства Hepadnaviridae ¹. Он может спровоцировать хроническую инфекцию, которая сохраняется на протяжении всей жизни, потенциально приводя к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме ^2,3,4. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2019 году население страны составляло 296 миллионов человек с хронической инфекцией гепатита В, и^{каждый год} 1,5 миллиона человек заражались новыми инфекциями.

протокол

В этом исследовании не участвовали люди или клинические образцы. Единственным использованным биологическим материалом был^4-й Международный стандарт ВОЗ по ДНК ВГВ для анализа нуклеиновых кислот (код NIBSC 10/266). Настоящий стандарт является общедоступным справочным материалом, не содержащим никакой личной информации или идентифицируемых данных. Таким образом, для этого исследования не требовалось никакого этического одобрения.

1. Экстракция ДНК

1. Извлечение вирусной ДНК из образца сыворотки или плазмы крови человека. Выделенную ДНК хранят при -20 °C до дальнейшего использования в ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реко....

Результаты

Принципиальная схема рабочего процесса по обнаружению и количественному определению ДНК вируса гепатита В из плазмы/сыворотки крови человека показана на рисунке 1. График усиления Стандарта 2 (используется в качестве ПК) и NTC как для HBV, так и для IC показан на р.......

Обсуждение

Коду NIBSC 10/266 присвоена единица 9,55,000 МЕ/мл при восстановлении в 0,5 мл безнуклеазной воды в соответствии с информацией поставщика²¹. Это можно считать высоконагруженным HBV-положительным образцом. Вирусная нагрузка ВГВ, определенная с помощью набора вирусной нагрузки, использ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198