JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sının gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için hassas ve doğru bir yöntemdir. Burada, HBV DNA tespiti ve bir numunenin viral yük ölçümü için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Hepatit B virüsü (HBV), dünya çapında karaciğer hastalığının önemli bir nedenidir. Akut veya kronik enfeksiyonlara yol açarak bireyleri ölümcül siroz ve karaciğer kanserine karşı oldukça duyarlı hale getirebilir. Kandaki HBV DNA'sının doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için gereklidir. HBV DNA'yı tespit etmek için en yaygın yöntem, virüsü tespit etmek ve antiviral tedaviye yanıtı izlemek için viral yükü değerlendirmek için kullanılabilen gerçek zamanlı PCR'dir. Burada, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Kit, HBV genomunun yüksek oranda korunmuş çekirdek bölgesini hedefleyen primerler ve problar kullanır ve tüm HBV genotiplerini (A, B, C, D, E, F, G, H, I ve J) doğru bir şekilde ölçebilir. Kit ayrıca olası PCR inhibisyonunu izlemek için endojen bir dahili kontrol içerir. Bu test 40 döngü boyunca çalışır ve kesilmesi 38 Ct'dir. Klinik örneklerde HBV DNA'sının miktar tayini için kit ile birlikte 5 miktar tayini standardı seti sağlanır. Standartlar, nükleik asit testi için 4. DSÖ Uluslararası HBV DNA Standardına (NIBSC kodu 10/266) göre kalibre edilmiş bilinen HBV'ye özgü DNA konsantrasyonlarını içerir. Standartlar, HBV'ye özgü DNA amplifikasyonunun işlevselliğini doğrulamak ve bir numunede HBV DNA'sının miktar tayinine izin veren standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. PCR kiti kullanılarak 2.5 IU/mL kadar düşük HBV DNA'sı tespit edildi. Kitin yüksek hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği, onu klinik laboratuvarlarda güçlü bir araç haline getirerek sağlık uzmanlarının HBV enfeksiyonlarını etkili bir şekilde teşhis etmesine ve yönetmesine yardımcı olur.

Giriş

Hepatit B virüsü (HBV), Orthohepadnavirus cinsi ve Hepadnaviridae ailesi1'den kısmen çift sarmallı bir DNA virüsüdür. Kişinin yaşamı boyunca devam eden ve potansiyel olarak karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomayol açan kronik bir enfeksiyonu tetikleyebilir 2,3,4. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 2019 yılında tahmini 296 milyon insan kronik hepatit B enfeksiyonu ile yaşıyordu ve her yıl 1,5 milyon kişi yeni enfekte oldu5.

Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın tanımlanması ve ölçümü, devam eden hepatit B enfeksiyonu olan bireyleri tespit etmek, antiviral tedavinin etkinliğini değerlendirmek ve tedavi başarısı olasılığını tahmin etmek için değerli bir yöntem olarak hizmet eder 6,7,8,9,10,11. Yüksek viral yük, siroz ve karaciğer kanseri dahil olmak üzere karaciğer hastalığının ilerlemesi riskinin artmasıyla ilişkilidir12,13. Bu nedenle, HBV enfeksiyonunun ilerlemesini izlemek ve tedavi ile ilgili kararları bildirmek için viral yükün hassas ölçümü çok önemlidir.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR testleri, geleneksel PCR tekniklerine göre daha yüksek duyarlılığa, daha geniş dinamik aralığa ve HBV DNA'sının daha doğru miktar tayinine sahiptir 14,15,16,17. Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın miktar tayini için çeşitli ticari gerçek zamanlı PCR tabanlı moleküler tanı kitleri piyasada mevcuttur. Burada, ticari olarak temin edilebilen, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir iş akışı açıklıyoruz. Kit, yaygın olarak kullanılan18,19, düşük maliyetli, ancak oldukça hassas bir tahlildir ve performans özellikleri, piyasada bulunan diğer CE işaretli kit(ler)18 ile karşılaştırılabilir. HBV hedef bölge amplifikasyonunun yanı sıra, numunelerin kalitesini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini, PCR amplifikasyonunu ve olası PCR inhibisyonunu doğrulamak için kite endojen bir dahili kontrol geni de dahil edilmiştir.

Protokol

Bu çalışma herhangi bir insan katılımcıyı veya klinik örneği içermemiştir. Kullanılan tek biyolojik materyal, nükleik asit testi için HBV DNA'sı için 4. DSÖ Uluslararası Standardı (NIBSC kodu 10/266) idi. Bu standart, herhangi bir kişisel bilgi veya tanımlanabilir veri içermeyen, kamuya açık bir referans materyalidir. Bu nedenle, bu çalışma için herhangi bir etik onay gerekmemiştir.

1. DNA Ekstraksiyonu

  1. Viral DNA'yı insan serumu veya plazma örneğinden çıkarın. Ekstrakte edilen DNA'yı PCR'de daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: DNA ekstraksiyonu için önerilen serum veya plazma hacmi 500 μL'dir ve elüsyon hacmi 50 μL'dir. Bu çalışmada, viral DNA, bir viral nükleik asit ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak ekstrakte edildi.

2. Gerçek zamanlı PCR

  1. PCR'ye başlamadan önce gerçek zamanlı PCR kitinin tüm reaktiflerini (Tablo 1) oda sıcaklığında (RT; 15-25 °C) çözün. Çözüldüğünde, bileşenleri orta hızda 10 saniye boyunca darbeli girdap ile karıştırın ve RT'de 15 saniye boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Çözülen tüm bileşenleri bir soğutma bloğunda tutun.
  2. Reaksiyon hazırlama
    1. Tablo 2'ye göre bir PCR karışımı hazırlayın. Numune sayısına, standartlara ve şablon kontrolüne göre eklenecek reaktiflerin hacmini hesaplayın.
      NOT: PCR karışımını hazırlarken, her bir reaktifin en az %10 ekstra hacmi eklenmelidir (örneğin, 10 reaksiyon gerekiyorsa, 11 reaksiyon için hesaplayın).
    2. Yukarıda hazırlanmış PCR karışımının 15 μL'sini her bir PCR tüpüne pipetleyin. Ardından, ekstrakte edilmiş örnek DNA'dan 15 μL ekleyin. HBV DNA'sını tespit etmek için pozitif kontrol (PC) olarak HBV standartlarından en az birinden (HBV Standardı 1-5) 15 μL ve negatif kontrol (NC) olarak 15 μL PCR dereceli nükleaz içermeyen su ekleyin. HBV DNA'nın kantitasyonu için gerekli standart bir eğri oluşturmak için, her PCR çalıştırması için kit ile birlikte verilen 5 kantitasyon standardının tümünü (HBV Standardı 1-5) kullanın.
    3. Tüpleri kapatın, bileşenleri orta hızda 10 saniye boyunca darbeli girdapla karıştırın ve termal döngüleyiciye geçmeden önce RT'de 15 saniye boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Floresan algılamayı engelleyebileceğinden, reaksiyon karışımında kabarcık olmadığından emin olun.
  3. Program kurulumu
    1. Termal döngüleyiciyi Tablo 3'te önerildiği gibi döngü koşullarını kullanarak programlayın.
  4. Kanal/Florofor Seçimi
    1. Tablo 4'te belirtildiği gibi, yaygın olarak kullanılan gerçek zamanlı PCR platformları için floresan boyaları seçin.
  5. Veri analizi
    1. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, amplifikasyon grafiğini doğrusal bir ölçekte analiz edin.
    2. Eşik ayarı
      1. Bir PCR reaksiyonunun üstel fazı içindeki eşiği ayarlayın. Kit için önerilen eşik değerleri Tablo 5'te belirtilmiştir. Eşik ayarıyla tutarlı olun. Test için en uygun eşik belirlendikten sonra, belirli bir PCR makinesi için tüm numuneler için tutarlı bir şekilde kullanın. Bu, sonuçların doğru ve tekrarlanabilir olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.
        NOT: Eşik çok düşük ayarlanırsa, sinyal gürültü seviyesinin altında olabilir ve Ct değeri güvenilmez olacaktır. Eşik çok yükseğe ayarlanırsa, sinyal, amplifikasyonun o kadar verimli olmadığı ve Ct değerinin yanlış olabileceği reaksiyonun plato fazında olabilir.
    3. Kesme
      1. Kiti 40 amplifikasyon döngüsü için çalıştırın. Herhangi bir yorumlama için 38 döngünün ötesinde herhangi bir amplifikasyon düşünmeyin.
    4. Nitel sonuç analizi
      1. HBV DNA'nın kalitatif tespiti için kiti kullanın. Standart 2'yi HBV için 20 ± 2'de ve IC için 24 ± 3'te beklenen Ct değerleriyle PC olarak kullanın.
      2. Hiçbir şablon kontrolünün (NTC) hem HBV hem de dahili kontrol (IC) hedefleri için herhangi bir amplifikasyon göstermediğinden emin olun. NTC reaksiyonunda bir amplifikasyon reaksiyonu meydana gelirse, numune kontaminasyonu meydana gelmiş olabilir.
      3. Test sınırı 38 olduğundan, HBV hedefi için 38 Ct'den önceki herhangi bir amplifikasyonu HBV pozitif bir numune olarak düşünün. Tüm kontroller yukarıda belirtilen gereksinimleri karşıladığında, Tablo 6'da belirtilen yorumları izleyen bir örnek düşünün.
    5. Nicel sonuç analizi
      1. Nükleik asit amplifikasyon teknikleri (NAT) için HBV DNA için 4. DSÖ Uluslararası standardına göre kalibre edilmiş HBV'ye özgü DNA için bilinen konsantrasyonların 5 miktar tayini standardı setini kullanın (NAT)20 (Tablo 7).
      2. Standart bir eğri oluşturmak için bu standartları kullanın. Bilinmeyen bir numunenin HBV DNA'sını ölçmek için standart eğriyi kullanın.
        NOT: Gerçek zamanlı PCR yazılımı, 5 standardın tümünün HBV hedefleri için elde edilen Ct değerlerini ve bunların mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) karşılık gelen konsantrasyonlarını kullanarak standart bir eğri oluşturacaktır.
      3. Bilinmeyen numuneler için değerleri yalnızca standartların eğimi -3.1 ile -3.6 arasındaysa,R2 değeri 0.99 ile 1.0 arasındaysa, PCR verimliliği %90-%110 (0.9-1.1) arasındaysa ve negatif kontrolde amplifikasyon yoksa yorumlayın.
      4. Yazılım, her HBV pozitif numunenin konsantrasyonunu mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) hesaplayacaktır. Viral yükü hesaplamak için (IU/μL'nin mililitre başına uluslararası birimlere [IU/mL]), aşağıdaki denklemi kullanın:
        Sonuç (IU/mL) = (Sonuç [IU/μL] x Elüsyon Hacmi [μL])/ Numune Hacmi (mL)
        NOT: HBV DNA için 4. DSÖ Uluslararası Standardı, NIBSC kodu 10/266, 0.5 mL plazmadan viral DNA saflaştırması için ekstrakte edildi, saflaştırılmış viral DNA'yı 50 μL elüsyon tamponuna ayrıştırdı ve PCR kiti ile birlikte 5 HBV standardı ve NTC ile birlikte referans numune olarak kullanıldı. Referans numunenin (NIBSC kodu 10/266) HBV viral yükü (6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL olarak hesaplandı.

Sonuçlar

İnsan plazmasından/serumundan HBV DNA'sını tespit etmek ve ölçmek için iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. Hem HBV hem de IC için Standart 2 (PC olarak kullanılır) ve NTC'nin bir amplifikasyon grafiği Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 3 , bir HBV-pozitif numune, bir HBV-negatif numune ve PCR inhibisyonu olan bir numune için amplifikasyon eğrilerini göstermektedir. NIBSC kodu 10/2...

Tartışmalar

NIBSC kodu 10/266, tedarikçi bilgilerine göre 9,55,000 mL nükleaz içermeyen suda sulandırıldığında 0.5 IU/mL'lik bir birim olarak atanmıştır21. Bu, yüksek yüklü bir HBV pozitif numune olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada kullanılan viral yük kiti ile belirlenen HBV viral yükü 6,65,900 IU/mL idi (Şekil 4). Herhangi bir DNA ekstraksiyon kitinin DNA ekstraksiyon verimliliği %100 olmadığından, saflaştırma işlemi sırasında genellikle bir mi...

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan HBV viral yük kitinin üreticisi olan Kilpest India Limited ile ilişkilidir.

Teşekkürler

Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita ve Shikha'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNANIBSCNIBSC code: 10/266The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines ThermoFisher ScientificABI 7500; QuantStudio 5This is a real time PCR machine 
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198NIBSCNIBSC code: 14/198This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machineQiagenRotor-Gene QThis is a real time PCR machine 
TRUPCR HBV Viral Load kit Kilpest India Limited3B294This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction KitKilpest India Limited3B214This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198

Referanslar

  1. Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  3. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  4. Huang, Y. -. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
  5. . World Health Organization fact sheet Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023)
  6. Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
  7. Chan, H. L. -. Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
  8. Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
  9. Liu, C. -. J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
  10. Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
  11. Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
  12. Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
  13. Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
  14. Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
  15. Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
  16. Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -. A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
  17. Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
  18. Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
  19. Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
  20. NIBSC-Code:10/266. . Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , (2016).
  21. Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
  22. Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
  23. . Nibsc-14/198 Available from: https://www.nibsc.org/ (2023)
  24. Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 202hepatit B vir s HBVviral y kger ek zamanl PCRstandartlarstandart e riCt de eriendojen internal kontrol

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır