Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-basierter Nachweis und Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA

Zusammenfassung

Der auf der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Nachweis und die Quantifizierung der DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) ist eine empfindliche und genaue Methode zur Diagnose und Überwachung von HBV-Infektionen. Hier stellen wir ein Protokoll für den HBV-DNA-Nachweis und die Viruslastmessung einer Probe vor.

Zusammenfassung

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist weltweit eine der Hauptursachen für Lebererkrankungen. Es kann zu akuten oder chronischen Infektionen führen, was die Menschen sehr anfällig für tödliche Leberzirrhose und Leberkrebs macht. Der genaue Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA im Blut sind für die Diagnose und Überwachung einer HBV-Infektion unerlässlich. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von HBV-DNA ist die Echtzeit-PCR, mit der das Virus nachgewiesen und die Viruslast beurteilt werden kann, um das Ansprechen auf eine antivirale Therapie zu überwachen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Das Kit verwendet Primer und Sonden, die auf die hochkonservierte Kernregion des HBV-Genoms abzielen und alle HBV-Genotypen (A, B, C, D, E, F, G, H, I und J) genau quantifizieren können. Das Kit enthält auch eine endogene interne Kontrolle zur Überwachung einer möglichen PCR-Hemmung. Dieser Assay läuft über 40 Zyklen und sein Cutoff liegt bei 38 Ct. Für die Quantifizierung von HBV-DNA in klinischen Proben wird ein Satz von 5 Quantifizierungsstandards mit dem Kit geliefert. Die Standards enthalten bekannte Konzentrationen von HBV-spezifischer DNA, die gegen den 4^. Internationalen Standard der WHO für HBV-DNA für den Nukleinsäuretest (NIBSC-Code 10/266) kalibriert sind. Die Standards werden verwendet, um die Funktionalität der HBV-spezifischen DNA-Amplifikation zu validieren und eine Standardkurve zu erstellen, die die Quantifizierung von HBV-DNA in einer Probe ermöglicht. HBV-DNA mit einem Gehalt von nur 2,5 IE/ml wurde mit dem PCR-Kit nachgewiesen. Die hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Kits machen es zu einem leistungsstarken Werkzeug in klinischen Labors, das medizinisches Fachpersonal bei der effektiven Diagnose und Behandlung von HBV-Infektionen unterstützt.

Einleitung

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein teilweise doppelsträngiges DNA-Virus aus der Gattung Orthohepadnavirus und der Familie der Hepadnaviridae ¹. Es kann eine chronische Infektion auslösen, die ein Leben lang anhält und möglicherweise zu Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom führt ^2,3,4. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) lebten im Jahr 2019 schätzungsweise 296 Millionen Menschen mit einer chronischen Hepatitis-B-Infektion, und^{jedes Jahr} infizierten sich 1,5 Millionen Menschen neu 5.

Die Identifizierung und Messung von HBV-DNA in Serum- oder Plasmaproben dient als wertvolle Methode zum Nachweis von Personen mit einer laufenden Hepatitis-B-Infektion, zur Beurteilung der Wirksamkeit einer antiviralen Behandlung und zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolgs 6,7,8,9,10,11. Eine hohe Viruslast ist mit einem erhöhten Risiko für das Fortschreiten von Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Leberkrebs, verbunden^12,13. Daher ist eine präzise Messung der Viruslast von entscheidender Bedeutung, um das Fortschreiten der HBV-Infektion zu verfolgen und Entscheidungen über die Behandlung zu treffen.

Quantitative Real-Time-PCR-Assays haben eine höhere Sensitivität, einen breiteren Dynamikbereich und eine genauere Quantifizierung der HBV-DNA als herkömmliche PCR-Techniken 14,15,16,17. Auf dem Markt sind mehrere kommerzielle real-time PCR-basierte molekulardiagnostische Kits für die Quantifizierung von HBV-DNA in Serum- oder Plasmaproben erhältlich. Hier beschreiben wir einen detaillierten Arbeitsablauf für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen, IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Bei dem Kit handelt es sich um einen weit verbreiteten, kostengünstigen und dennoch hochempfindlichen ^18,19-Test, dessen Leistungsmerkmale mit denen anderer kommerziell erhältlicher CE-gekennzeichneter Kits vergleichbar ^sind18. Neben der Amplifikation der HBV-Zielregion ist auch ein endogenes internes Kontrollgen im Kit enthalten, um die Qualität der Proben, die Qualität der extrahierten DNA, die PCR-Amplifikation und eine mögliche PCR-Hemmung zu überprüfen.

Protokoll

An dieser Studie wurden keine menschlichen Teilnehmer oder klinischen Proben beteiligt. Das einzige biologische Material, das verwendet wurde, war der 4^. Internationale Standard der WHO für HBV-DNA für Nukleinsäuretests (NIBSC-Code 10/266). Bei dieser Norm handelt es sich um ein öffentlich zugängliches Referenzmaterial, das keine personenbezogenen oder identifizierbaren Daten enthält. Daher war für diese Studie keine ethische Genehmigung erforderlich.

1. DNA-Extraktion

1. Extrahieren Sie die virale DNA aus einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe. Lagern Sie die extrahierte DNA bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung in der PCR.
   HINWEIS: Das empfohlene Serum- oder Plasmavolumen für die DNA-Extraktion beträgt 500 μl und das Elutionsvolumen 50 μl. In dieser Studie wurde die virale DNA mit einem viralen Nukleinsäure-Extraktionskit extrahiert (Materialtabelle).

2. Echtzeit-PCR

1. Tauen Sie alle Reagenzien (Tabelle 1) des Real-Time-PCR-Kits bei Raumtemperatur (RT; 15-25 °C) auf, bevor Sie mit der PCR beginnen. Nach dem Auftauen werden die Komponenten durch Impulswirbeln für 10 s bei moderater Geschwindigkeit gemischt und bei 8.000 × g 15 s bei RT zentrifugiert. Alle aufgetauten Komponenten auf einem Kühlblock aufbewahren.
2. Vorbereitung der Reaktion
   1. Bereiten Sie eine PCR-Mischung gemäß Tabelle 2 vor. Berechnen Sie das Volumen der hinzuzufügenden Reagenzien basierend auf der Anzahl der Proben, Standards und ohne Template-Kontrolle.
      HINWEIS: Bei der Herstellung der PCR-Mischung sollten mindestens 10 % zusätzliches Volumen jedes Reagenzes hinzugefügt werden (z. B. wenn 10 Reaktionen erforderlich sind, rechnen Sie mit 11 Reaktionen).
   2. Pipettieren Sie 15 μl der oben zubereiteten PCR-Mischung in jedes PCR-Röhrchen. Geben Sie dann 15 μl der extrahierten Proben-DNA hinzu. Fügen Sie 15 μl mindestens eines der Standards für HBV (HBV-Standard 1-5) als Positivkontrolle (PC) zum Nachweis von HBV-DNA und 15 μl nukleasefreies Wasser in PCR-Qualität als Negativkontrolle (NC) hinzu. Um eine Standardkurve zu erstellen, die für die Quantifizierung der HBV-DNA erforderlich ist, verwenden Sie für jeden PCR-Lauf alle 5 mit dem Kit gelieferten Quantifizierungsstandards (HBV-Standard 1-5).
   3. Verschließen Sie die Röhrchen, mischen Sie die Komponenten durch Pulswirbeln für 10 s bei moderater Geschwindigkeit und zentrifugieren Sie bei 8.000 × g für 15 s bei RT, bevor Sie zum Thermocycler gelangen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Reaktionsmischung befinden, da dies die Fluoreszenzdetektion beeinträchtigen kann.
3. Einrichtung des Programms
   1. Programmieren Sie den Thermocycler unter den in Tabelle 3 empfohlenen Zyklusbedingungen.
4. Kanal-/Fluorophor-Auswahl
   1. Wählen Sie die Fluoreszenzfarbstoffe für häufig verwendete Real-Time-PCR-Plattformen aus, wie in Tabelle 4 beschrieben.
5. Datenanalyse
   1. Analysieren Sie nach Abschluss des Laufs das Verstärkungsdiagramm auf einer linearen Skala.
   2. Einstellung des Schwellenwerts
      1. Legen Sie den Schwellenwert innerhalb der exponentiellen Phase einer PCR-Reaktion fest. Die empfohlenen Schwellenwerte für das Kit sind in Tabelle 5 aufgeführt. Halten Sie sich konsequent an die Einstellung des Schwellenwerts. Sobald der optimale Schwellenwert für den Assay bestimmt ist, verwenden Sie ihn konsistent für alle Proben für ein bestimmtes PCR-Gerät. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse genau und reproduzierbar sind.
         HINWEIS: Wenn der Schwellenwert zu niedrig eingestellt ist, kann das Signal unter dem Rauschpegel liegen, und der Ct-Wert ist unzuverlässig. Wenn der Schwellenwert zu hoch eingestellt ist, kann sich das Signal in der Plateauphase der Reaktion befinden, in der die Verstärkung nicht so effizient ist, und der Ct-Wert kann ungenau sein.
   3. Abkürzung
      1. Führen Sie das Kit für 40 Amplifikationszyklen aus. Berücksichtigen Sie keine Verstärkung über 38 Zyklen hinaus für die Interpretation.
   4. Qualitative Ergebnisanalyse
      1. Verwenden Sie das Kit für den qualitativen Nachweis von HBV-DNA. Verwenden Sie Standard 2 als PC mit erwarteten Ct-Werten von 20 ± 2 für HBV und 24 ± 3 für IC.
      2. Stellen Sie sicher, dass keine Template-Kontrolle (NTC) keine Verstärkung sowohl für HBV- als auch für IC-Ziele (Internal Control Targets) aufweist. Wenn in der NTC-Reaktion eine Amplifikationsreaktion auftritt, kann es zu einer Probenkontamination gekommen sein.
      3. Da der Cutoff-Wert des Assays bei 38 liegt, sollte jede Amplifikation vor 38 Ct für das HBV-Ziel als HBV-positive Probe betrachtet werden. Wenn alle Kontrollen die oben genannten Anforderungen erfüllen, ist eine Probe gemäß den in Tabelle 6 genannten Interpretationen in Betracht zu ziehen.
   5. Quantitative Ergebnisanalyse
      1. Verwenden Sie den Satz von 5 Quantifizierungsstandards bekannter Konzentrationen für HBV-spezifische DNA, die anhand des 4. Internationalen Standards der WHO für HBV-DNA für Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)²⁰ kalibriert sind (Tabelle 7).
      2. Verwenden Sie diese Standards, um eine Standardkurve zu erstellen. Verwenden Sie die Standardkurve, um die HBV-DNA einer unbekannten Probe zu quantifizieren.
         HINWEIS: Die Real-Time-PCR-Software generiert eine Standardkurve mit den Ct-Werten, die für die HBV-Ziele aller 5 Standards und den entsprechenden Konzentrationen in internationalen Einheiten pro Mikroliter (IE/μl) erhalten wurden.
      3. Interpretieren Sie die Werte für unbekannte Proben nur, wenn die Steigung der Standards zwischen -3,1 und -3,6 liegt, der^R2-Wert zwischen 0,99 und 1,0 liegt, die PCR-Effizienz zwischen 90 % und 110 % (0,9-1,1) liegt und keine Amplifikation in der Negativkontrolle vorliegt.
      4. Die Software berechnet die Konzentration jeder HBV-positiven Probe in internationalen Einheiten pro Mikroliter (IE/μl). Um die Viruslast (Umrechnung von IE/μl in internationale Einheiten pro Milliliter [IE/ml]) zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
         Ergebnis (IE/ml) = (Ergebnis [IE/μl] x Elutionsvolumen [μl])/ Probenvolumen (mL)
         ANMERKUNG: Der 4^. Internationale Standard der WHO für HBV-DNA, NIBSC-Code 10/266, wurde für die virale DNA-Aufreinigung aus 0,5 ml Plasma extrahiert, die gereinigte virale DNA in 50 μl Elutionspuffer eluiert und mit dem PCR-Kit als Referenzprobe zusammen mit den 5 HBV-Standards und NTC verwendet. Die HBV-Viruslast der Referenzprobe (NIBSC-Code 10/266) wurde wie folgt berechnet: (6659 IE/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6.65.900 IE/mL.

Ergebnisse

Ein schematisches Diagramm des Arbeitsablaufs zum Nachweis und zur Quantifizierung von HBV-DNA aus menschlichem Plasma/Serum ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Verstärkungsdiagramm von Standard 2 (als PC verwendet) und NTC für HBV und IC ist in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Amplifikationskurven für eine HBV-positive, eine HBV-negative Probe und eine Probe mit PCR-Inhibition. Die Amplifikationskurve, der Ct-Wert ...

Diskussion

Dem NIBSC-Code 10/266 wurde eine Einheit von 9.55.000 IE/ml zugewiesen, wenn er in 0,5 ml nukleasefreiem Wasser gemäß den Lieferanteninformationen²¹ rekonstituiert wird. Dies kann als hochbelastete HBV-positive Probe betrachtet werden. Die HBV-Viruslast, die mit dem in dieser Studie verwendeten Viruslast-Kit bestimmt wurde, betrug 6.65.900 IE/ml (Abbildung 4). Da die DNA-Extraktionseffizienz eines DNA-Extraktionskits nicht 100 % beträgt, geht während des Reinigung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198