Détection et quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B par réaction en chaîne par polymérase

Résumé

La détection et la quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B (VHB) par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel constituent une méthode sensible et précise de diagnostic et de surveillance de l’infection par le VHB. Nous présentons ici un protocole de détection de l’ADN du VHB et de mesure de la charge virale d’un échantillon.

Résumé

Le virus de l’hépatite B (VHB) est une cause importante de maladie du foie dans le monde. Elle peut entraîner des infections aiguës ou chroniques, ce qui rend les individus très vulnérables à la cirrhose mortelle et au cancer du foie. La détection et la quantification précises de l’ADN du VHB dans le sang sont essentielles pour diagnostiquer et surveiller l’infection par le VHB. La méthode la plus courante pour détecter l’ADN du VHB est la PCR en temps réel, qui peut être utilisée pour détecter le virus et évaluer la charge virale afin de surveiller la réponse au traitement antiviral. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB dans le sérum ou le plasma humain à l’aide d’un kit PCR en temps réel marqué IVD. Le kit utilise des amorces et des sondes qui ciblent la région centrale hautement conservée du génome du VHB et peuvent quantifier avec précision tous les génotypes du VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I et J). Le kit comprend également un contrôle interne endogène pour surveiller une éventuelle inhibition de la PCR. Ce test dure 40 cycles et sa limite est de 38 Ct. Pour la quantification de l’ADN du VHB dans les échantillons cliniques, un ensemble de 5 étalons de quantification est fourni avec le kit. Les étalons contiennent des concentrations connues d’ADN spécifique du VHB qui sont calibrées par rapport à la 4^e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour le test d’acide nucléique (code NIBSC 10/266). Les étalons sont utilisés pour valider la fonctionnalité de l’amplification de l’ADN spécifique au VHB et pour générer une courbe standard, permettant la quantification de l’ADN du VHB dans un échantillon. L’ADN du VHB aussi faible que 2,5 UI/mL a été détecté à l’aide du kit PCR. La haute sensibilité et la reproductibilité du kit en font un outil puissant dans les laboratoires cliniques, aidant les professionnels de la santé à diagnostiquer et à gérer efficacement les infections à VHB.

Introduction

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus à ADN partiellement double brin du genre Orthohepadnavirus et de la famille des Hepadnaviridae ¹. Il peut déclencher une infection chronique qui persiste tout au long de la vie, pouvant entraîner une cirrhose du foie et un carcinome hépatocellulaire ^2,3,4. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), une population estimée à 296 millions de personnes vivait avec une infection chronique par le virus de l’hépatite B en 2019, et 1,5 million de personnes étaient nouvellement infectées chaque année⁵.

L’identification et la mesure de l’ADN du VHB dans des échantillons de sérum ou de plasma constituent une méthode précieuse pour détecter les personnes atteintes d’une infection continue par le virus de l’hépatite B, évaluer l’efficacité du traitement antiviral et prédire la probabilité de succès du traitement 6,7,8,9,10,11. Une charge virale élevée est associée à un risque accru de progression de la maladie du foie, y compris la cirrhose et le cancer du foie^12,13. Par conséquent, une mesure précise de la charge virale est cruciale pour suivre la progression de l’infection par le VHB et éclairer les décisions concernant le traitement.

Les tests PCR quantitatifs en temps réel ont une sensibilité plus élevée, une plage dynamique plus large et une quantification plus précise de l’ADN du VHB que les techniques de PCR conventionnelles 14,15,16,17. Plusieurs kits commerciaux de diagnostic moléculaire basés sur la PCR en temps réel pour la quantification de l’ADN du VHB dans des échantillons de sérum ou de plasma sont disponibles sur le marché. Nous décrivons ici un flux de travail détaillé pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB dans le sérum ou le plasma humain à l’aide d’un kit de PCR en temps réel marqué IVD disponible dans le commerce. Il s’agit d’un test^18,19 largement utilisé, peu coûteux mais très sensible, et ses caractéristiques de performance sont comparables à celles d’autres kits portant le marquage ^CE18 disponibles dans le commerce. Outre l’amplification de la région cible du VHB, un gène de contrôle interne endogène est également inclus dans le kit pour vérifier la qualité des échantillons, la qualité de l’ADN extrait, l’amplification par PCR et l’inhibition éventuelle de la PCR.

Protocole

Cette étude n’a pas impliqué de participants humains ou d’échantillons cliniques. Le seul matériel biologique utilisé était la 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour le test d’acide nucléique (code NIBSC 10/266). Cette norme est un document de référence accessible au public qui ne contient pas d’informations personnelles ou de données identifiables. Par conséquent, aucune approbation éthique n’était requise pour cette étude.

1. Extraction de l’ADN

1. Extraire l’ADN viral d’un échantillon de sérum ou de plasma humain. Conservez l’ADN extrait à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé en PCR.
   REMARQUE : Le volume recommandé de sérum ou de plasma pour l’extraction de l’ADN est de 500 μL et le volume d’élution est de 50 μL. Dans cette étude, l’ADN viral a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction d’acide nucléique viral (Table of Materials).

2. PCR en temps réel

1. Décongelez tous les réactifs (tableau 1) du kit de PCR en temps réel à température ambiante (RT ; 15-25 °C) avant de commencer la PCR. Une fois décongelés, mélanger les composants par vortex pulsé pendant 10 s à une vitesse modérée et centrifuger à 8 000 × g pendant 15 s à RT. Conserver tous les composants décongelés sur un bloc de refroidissement.
2. Préparation de la réaction
   1. Préparez un mélange PCR conformément au tableau 2. Calculez le volume de réactifs à ajouter en fonction du nombre d’échantillons, des étalons et de l’absence de contrôle de modèle.
      REMARQUE : Lors de la préparation du mélange PCR, il faut ajouter au moins 10 % de volume supplémentaire de chaque réactif (p. ex., si 10 réactions sont nécessaires, calculer pour 11 réactions).
   2. Injecter 15 μL du mélange PCR préparé ci-dessus dans chaque tube PCR. Ensuite, ajoutez 15 μL de l’ADN de l’échantillon extrait. Ajouter 15 μL d’au moins un des étalons pour le VHB (norme HBV 1-5) comme témoin positif (PC) pour détecter l’ADN du VHB et 15 μL d’eau exempte de nucléase de qualité PCR comme témoin négatif (NC). Pour générer une courbe standard requise pour la quantification de l’ADN du VHB, utilisez les 5 étalons de quantification fournis avec le kit (norme HBV 1-5) pour chaque cycle de PCR.
   3. Fermer les tubes, mélanger les composants par vortex pulsé pendant 10 s à vitesse modérée et centrifuger à 8 000 × g pendant 15 s à RT avant de passer au thermocycleur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le mélange réactionnel, car cela pourrait interférer avec la détection de fluorescence.
3. Configuration du programme
   1. Programmez le thermocycleur en utilisant les conditions de cyclage recommandées dans le tableau 3.
4. Sélection de canaux/fluorophores
   1. Sélectionnez les colorants fluorescents pour les plateformes de PCR en temps réel couramment utilisées, comme indiqué dans le tableau 4.
5. Analyse des données
   1. Une fois l’exécution terminée, analysez le tracé d’amplification à l’échelle linéaire.
   2. Réglage du seuil
      1. Définissez le seuil dans la phase exponentielle d’une réaction PCR. Les valeurs seuils recommandées pour le kit sont mentionnées dans le tableau 5. Soyez cohérent avec le paramètre de seuil. Une fois que le seuil optimal pour le test est déterminé, utilisez-le de manière cohérente pour tous les échantillons d’une machine PCR particulière. Cela permettra de s’assurer que les résultats sont précis et reproductibles.
         REMARQUE : Si le seuil est réglé trop bas, le signal peut être inférieur au niveau de bruit et la valeur Ct ne sera pas fiable. Si le seuil est trop élevé, le signal peut se trouver dans la phase de plateau de la réaction, où l’amplification n’est pas aussi efficace, et la valeur Ct peut être imprécise.
   3. Raccourci
      1. Faites fonctionner le kit pendant 40 cycles d’amplification. Ne considérez aucune amplification au-delà de 38 cycles pour toute interprétation.
   4. Analyse qualitative des résultats
      1. Utilisez le kit pour la détection qualitative de l’ADN du VHB. Utiliser la norme 2 comme PC avec des valeurs de Ct attendues à 20 ± 2 pour le VHB et 24 ± 3 pour l’IC.
      2. Assurez-vous qu’aucun contrôle de modèle (NTC) ne présente d’amplification pour les cibles HBV et de contrôle interne (IC). Si une réaction d’amplification se produit dans la réaction NTC, il est possible que l’échantillon ait été contaminé.
      3. Étant donné que le seuil de dosage est de 38, considérez toute amplification avant 38 Ct pour la cible du VHB comme un échantillon positif pour le VHB. Lorsque tous les témoins satisfont aux exigences énoncées ci-dessus, envisager un spécimen suivant les interprétations mentionnées dans le tableau 6.
   5. Analyse quantitative des résultats
      1. Utiliser l’ensemble de 5 étalons de quantification des concentrations connues pour l’ADN spécifique du VHB qui sont calibrés par rapport à la 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour les techniques d’amplification des acides nucléiques (NAT)²⁰ (tableau 7).
      2. Utilisez ces normes pour générer une courbe standard. Utilisez la courbe standard pour quantifier l’ADN du VHB d’un échantillon inconnu.
         REMARQUE : Le logiciel de PCR en temps réel générera une courbe standard à l’aide des valeurs Ct obtenues pour les cibles HBV des 5 étalons et de leurs concentrations correspondantes en unités internationales par microlitre (UI/μL).
      3. N’interprétez les valeurs des échantillons inconnus que si la pente des étalons se situe entre -3,1 et -3,6, la valeur R² est comprise entre 0,99 et 1,0, l’efficacité de la PCR est comprise entre 90 % et 110 % (0,9-1,1) et s’il n’y a pas d’amplification dans le témoin négatif.
      4. Le logiciel calculera la concentration de chaque échantillon positif pour le VHB en unités internationales par microlitre (UI/μL). Pour calculer la charge virale (conversion de l’UI/μL en unités internationales par millilitre [UI/mL]), utilisez l’équation suivante :
         Résultat (UI/mL) = (Résultat [UI/μL] x Volume d’élution [μL])/ Volume d’échantillon (mL)
         NOTE : La 4^e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB, code 10/266 du NIBSC, a été extraite pour la purification de l’ADN viral à partir de 0,5 mL de plasma, éluée l’ADN viral purifié dans 50 μL de tampon d’élution et utilisée avec le kit PCR comme échantillon de référence avec les 5 étalons du VHB et le NTC. La charge virale VHB de l’échantillon de référence (code NIBSC 10/266) a été calculée comme suit : (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65 900 UI/mL.

Résultats

La figure 1 présente un diagramme schématique du processus de détection et de quantification de l’ADN du VHB à partir du plasma/sérum humain. La figure 2 présente un diagramme d’amplification de la norme 2 (utilisée comme PC) et de la NTC pour le VHB et l’IC. La figure 3 montre les courbes d’amplification d’un échantillon positif pour le VHB, d’un échantillon négatif pour le VHB et d’un échantillon avec inhi...

Discussion

Le code NIBSC 10/266 s’est vu attribuer une unité de 9,55,000 UI/mL lorsqu’il est reconstitué dans 0,5 mL d’eau exempte de nucléases conformément aux informations fournies par le fournisseur²¹. Cela peut être considéré comme un échantillon positif pour le VHB à forte charge. La charge virale du VHB déterminée par la trousse de charge virale utilisée dans cette étude était de 6 65 900 UI/mL (figure 4). Comme l’efficacité d’extraction de l’ADN...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198