Détection et quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B par réaction en chaîne par polymérase

Résumé

La détection et la quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B (VHB) par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel constituent une méthode sensible et précise de diagnostic et de surveillance de l’infection par le VHB. Nous présentons ici un protocole de détection de l’ADN du VHB et de mesure de la charge virale d’un échantillon.

Résumé

Le virus de l’hépatite B (VHB) est une cause importante de maladie du foie dans le monde. Elle peut entraîner des infections aiguës ou chroniques, ce qui rend les individus très vulnérables à la cirrhose mortelle et au cancer du foie. La détection et la quantification précises de l’ADN du VHB dans le sang sont essentielles pour diagnostiquer et surveiller l’infection par le VHB. La méthode la plus courante pour détecter l’ADN du VHB est la PCR en temps réel, qui peut être utilisée pour détecter le virus et évaluer la charge virale afin de surveiller la réponse au traitement antiviral. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB dans le sérum ou le plasma humain à l’aide d’un kit PCR en temps réel marqué IVD. Le kit utilise des amorces et des sondes qui ciblent la région centrale hautement conservée du génome du VHB et peuvent quantifier avec précision tous les génotypes du VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I et J). Le kit comprend également un contrôle interne endogène pour surveiller une éventuelle inhibition de la PCR. Ce test dure 40 cycles et sa limite est de 38 Ct. Pour la quantification de l’ADN du VHB dans les échantillons cliniques, un ensemble de 5 étalons de quantification est fourni avec le kit. Les étalons contiennent des concentrations connues d’ADN spécifique du VHB qui sont calibrées par rapport à la 4^e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour le test d’acide nucléique (code NIBSC 10/266). Les étalons sont utilisés pour valider la fonctionnalité de l’amplification de l’ADN spécifique au VHB et pour générer une courbe standard, permettant la quantification de l’ADN du VHB dans un échantillon. L’ADN du VHB aussi faible que 2,5 UI/mL a été détecté à l’aide du kit PCR. La haute sensibilité et la reproductibilité du kit en font un outil puissant dans les laboratoires cliniques, aidant les professionnels de la santé à diagnostiquer et à gérer efficacement les infections à VHB.

Introduction

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus à ADN partiellement double brin du genre Orthohepadnavirus et de la famille des Hepadnaviridae ¹. Il peut déclencher une infection chronique qui persiste tout au long de la vie, pouvant entraîner une cirrhose du foie et un carcinome hépatocellulaire ^2,3,4. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), une population estimée à 296 millions de personnes vivait avec une infection chronique par le virus de l’hépatite B en 2019, et 1,5 million de personnes étaient nouvellement infectées chaque....

Protocole

Cette étude n’a pas impliqué de participants humains ou d’échantillons cliniques. Le seul matériel biologique utilisé était la 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour le test d’acide nucléique (code NIBSC 10/266). Cette norme est un document de référence accessible au public qui ne contient pas d’informations personnelles ou de données identifiables. Par conséquent, aucune approbation éthique n’était requise pour cette étude.

1. Extraction de l’ADN

1. Extraire l’ADN viral d’un échantillon de sérum ou de plasma humain. Conservez l’ADN extrait à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé en PCR.

Résultats

La figure 1 présente un diagramme schématique du processus de détection et de quantification de l’ADN du VHB à partir du plasma/sérum humain. La figure 2 présente un diagramme d’amplification de la norme 2 (utilisée comme PC) et de la NTC pour le VHB et l’IC. La figure 3 montre les courbes d’amplification d’un échantillon positif pour le VHB, d’un échantillon négatif pour le VHB et d’un échantillon avec inhi.......

Discussion

Le code NIBSC 10/266 s’est vu attribuer une unité de 9,55,000 UI/mL lorsqu’il est reconstitué dans 0,5 mL d’eau exempte de nucléases conformément aux informations fournies par le fournisseur²¹. Cela peut être considéré comme un échantillon positif pour le VHB à forte charge. La charge virale du VHB déterminée par la trousse de charge virale utilisée dans cette étude était de 6 65 900 UI/mL (figure 4). Comme l’efficacité d’extraction de l’ADN.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198