Detecção e quantificação em tempo real do DNA do vírus da hepatite B baseado na reação em cadeia da polimerase

Resumo

A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real é um método sensível e preciso para diagnosticar e monitorar a infecção pelo HBV. Aqui, apresentamos um protocolo para detecção do DNA do VHB e a medição da carga viral de uma amostra.

Resumo

O vírus da hepatite B (VHB) é uma importante causa de doença hepática em todo o mundo. Pode levar a infecções agudas ou crônicas, tornando os indivíduos altamente suscetíveis à cirrose fatal e ao câncer de fígado. A detecção e quantificação precisas do DNA do VHB no sangue são essenciais para o diagnóstico e monitoramento da infecção pelo VHB. O método mais comum para detectar o DNA do VHB é a PCR em tempo real, que pode ser usada para detectar o vírus e avaliar a carga viral para monitorar a resposta à terapia antiviral. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a detecção e quantificação do DNA do VHB em soro ou plasma humano usando um kit baseado em PCR em tempo real marcado com DIV. O kit usa primers e sondas que têm como alvo a região central altamente conservada do genoma do HBV e podem quantificar com precisão todos os genótipos do HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). O kit também inclui um controle interno endógeno para monitorar uma possível inibição da PCR. Este ensaio tem duração de 40 ciclos, e seu ponto de corte é de 38 Ct. Para a quantificação do DNA do VHB em amostras clínicas, um conjunto de 5 padrões de quantificação é fornecido com o kit. Os padrões contêm concentrações conhecidas de DNA específico para HBV que são calibradas de acordo com a^4ª Norma Internacional da OMS para DNA de HBV para o teste de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Os padrões são usados para validar a funcionalidade da amplificação de DNA específico para HBV e gerar uma curva padrão, permitindo a quantificação do DNA do HBV em uma amostra. DNA do VHB tão baixo quanto 2,5 UI/mL foi detectado usando o kit de PCR. A alta sensibilidade e reprodutibilidade do kit o tornam uma ferramenta poderosa em laboratórios clínicos, auxiliando os profissionais de saúde no diagnóstico e manejo efetivo das infecções por HBV.

Introdução

O vírus da hepatite B (VHB) é um vírus de DNA parcialmente de fita dupla do gênero Orthohepadnavirus e da família Hepadnaviridae ¹. Pode desencadear uma infecção crônica que persiste por toda a vida, podendo levar à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular2,3,4. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), uma população estimada de 296 milhões de pessoas vivia com infecção crônica por hepatite B em 2019, e 1,5 milhão de pessoas foram infectadas a cada ano⁵.

A identificação e a dosagem do DNA do VHB em amostras de soro ou plasma servem como um método valioso para detectar indivíduos com infecção contínua pelo vírus da hepatite B, avaliar a eficácia do tratamento antiviral e predizer a probabilidade de sucesso do tratamento 6,7,8,9,10,11. A alta carga viral está associada a um risco aumentado de progressão da doença hepática, incluindo cirrose e câncer hepático^12,13. Assim, a mensuração precisa da carga viral é crucial para acompanhar a progressão da infecção pelo VHB e informar as decisões sobre o tratamento.

Ensaios quantitativos de PCR em tempo real apresentam maior sensibilidade, maior faixa dinâmica e quantificação mais precisa do DNA do VHB do que as técnicas convencionais de PCR 14,15,16,17. Vários kits comerciais de diagnóstico molecular baseados em PCR em tempo real para a quantificação do DNA do VHB em amostras de soro ou plasma estão disponíveis no mercado. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho detalhado para a detecção e quantificação do DNA do HBV em soro ou plasma humano usando um kit baseado em PCR em tempo real marcado com IVD disponível comercialmente. O kit é um ensaio amplamente^{utilizado18,19}, de baixo custo, porém altamente sensível, e suas características de desempenho são comparáveis a outros kits com marcação CE disponíveis ^{comercialmente18}. Além da amplificação da região-alvo do VHB, um gene de controle interno endógeno também está incluído no kit para verificar a qualidade das amostras, qualidade do DNA extraído, amplificação por PCR e possível inibição da PCR.

Protocolo

Este estudo não envolveu nenhum participante humano ou amostras clínicas. O único material biológico utilizado foi a^4ª Norma Internacional da OMS para DNA do VHB para teste de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Esta norma é um material de referência disponível publicamente que não contém quaisquer informações pessoais ou dados identificáveis. Dessa forma, não foi necessária aprovação ética para este estudo.

1. Extração de DNA

1. Extrair o ADN viral de amostras de soro ou plasma humanos. Conservar o ADN extraído a -20 °C até nova utilização na PCR.
   NOTA: O volume recomendado de soro ou plasma para extração de DNA é de 500 μL, e o volume de eluição é de 50 μL. Neste estudo, o DNA viral foi extraído usando um kit de extração de ácido nucleico viral (Tabela de Materiais).

2. PCR em tempo real

1. Descongelar todos os reagentes (Tabela 1) do kit de PCR em tempo real à temperatura ambiente (TR; 15-25 °C) antes de iniciar a PCR. Quando descongelados, misture os componentes por vórtice de pulso por 10 s a uma velocidade moderada e centrifuja a 8.000 × g por 15 s em RT. Mantenha todos os componentes descongelados em um bloco de resfriamento.
2. Preparação da reação
   1. Preparar uma mistura de PCR de acordo com a Tabela 2. Calcule o volume dos reagentes a serem adicionados com base no número de amostras, padrões e nenhum controle de modelo.
      NOTA: Ao preparar a mistura de PCR, pelo menos 10% de volume extra de cada reagente deve ser adicionado (por exemplo, se forem necessárias 10 reações, calcular para 11 reações).
   2. Pipetar 15 μL da mistura de PCR acima preparada em cada tubo de PCR. Em seguida, adicione 15 μL do DNA da amostra extraída. Adicionar 15 μL de pelo menos um dos padrões para HBV (HBV Standard 1-5) como controle positivo (PC) para detecção de DNA do HBV e 15 μL de água livre de nuclease grau PCR como controle negativo (NC). Para gerar uma curva padrão necessária para a quantificação do DNA do HBV, use todos os 5 padrões de quantificação fornecidos com o kit (HBV Standard 1-5) para cada execução de PCR.
   3. Feche os tubos, misture os componentes por vórtice de pulso por 10 s a uma velocidade moderada e centrifuja a 8.000 × g por 15 s em RT antes de prosseguir para o termociclador. Certifique-se de que não há bolhas na mistura de reação, pois isso pode interferir na detecção de fluorescência.
3. Configuração do programa
   1. Programe o termociclador utilizando as condições de ciclagem recomendadas na Tabela 3.
4. Seleção de Canais/Fluoróforos
   1. Selecione os corantes fluorescentes para as plataformas de PCR em tempo real comumente usadas, conforme mencionado na Tabela 4.
5. Análise de dados
   1. Após o término da execução, analise o gráfico de amplificação em escala linear.
   2. Definição de limite
      1. Defina o limite dentro da fase exponencial de uma reação de PCR. Os valores limite recomendados para o kit são mencionados na Tabela 5. Seja consistente com a configuração de limite. Uma vez determinado o limiar ideal para o ensaio, use-o consistentemente para todas as amostras de uma máquina de PCR específica. Isso ajudará a garantir que os resultados sejam precisos e reproduzíveis.
         Observação : se o limite for definido muito baixo, o sinal pode estar abaixo do nível de ruído e o valor Ct não será confiável. Se o limiar for definido muito alto, o sinal pode estar na fase de platô da reação, onde a amplificação não é tão eficiente, e o valor de Ct pode ser impreciso.
   3. Corte
      1. Execute o kit para 40 ciclos de amplificação. Não considere qualquer amplificação além de 38 ciclos para qualquer interpretação.
   4. Análise qualitativa dos resultados
      1. Use o kit para detecção qualitativa do DNA do HBV. Use o padrão 2 como PC com valores esperados de Ct em 20 ± 2 para HBV e 24 ± 3 para IC.
      2. Certifique-se de que nenhum controle de modelo (NTC) não exiba nenhuma amplificação para os alvos HBV e de controle interno (IC). Se ocorrer uma reação de amplificação na reação NTC, pode ter ocorrido contaminação da amostra.
      3. Como o ponto de corte do ensaio é 38, considere qualquer amplificação antes de 38 Ct para o alvo do HBV como uma amostra positiva para HBV. Quando todos os controles atenderem aos requisitos acima mencionados, considere um espécime seguindo as interpretações mencionadas na Tabela 6.
   5. Análise quantitativa dos resultados
      1. Utilizar o conjunto de 5 padrões de quantificação de concentrações conhecidas para DNA específico do HBV que são calibrados de acordo com o 4º padrão internacional da OMS para DNA do HBV para técnicas de amplificação de ácidos nucleicos (NAT)²⁰ (Tabela 7).
      2. Utilize esses padrões para gerar uma curva padrão. Utilizar a curva padrão para quantificar o DNA do VHB de uma amostra desconhecida.
         NOTA: O software de PCR em tempo real irá gerar uma curva padrão usando os valores de Ct obtidos para os alvos de HBV de todos os 5 padrões e suas concentrações correspondentes em unidades internacionais por microlitro (UI/μL).
      3. Somente interpretar os valores para amostras desconhecidas se a inclinação dos padrões estiver entre -3,1 e -3,6, o valor de R² estiver entre 0,99 e 1,0, a eficiência da PCR estiver entre 90%-110% (0,9-1,1) e não houver amplificação no controle negativo.
      4. O software calculará a concentração de cada amostra positiva para HBV em unidades internacionais por microlitro (UI/μL). Para calcular a carga viral (conversão de UI/μL em unidades internacionais por mililitro [UI/mL]), use a seguinte equação:
         Resultado (UI/mL) = (Resultado [UI/μL] x Volume de Eluição [μL])/ Volume da Amostra (mL)
         NOTA: A^4ª Norma Internacional da OMS para DNA DO HBV, código NIBSC 10/266, foi extraída para purificação do DNA viral a partir de 0,5 mL de plasma, eluída do DNA viral purificado em 50 μL de tampão de eluição e usada com o kit de PCR como amostra de referência, juntamente com os 5 padrões de HBV e NTC. A carga viral do VHB da amostra de referência (código NIBSC 10/266) foi calculada como (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65,900 UI/mL.

Resultados

Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho para detectar e quantificar o DNA do VHB a partir do plasma/soro humano é mostrado na Figura 1. Um gráfico de amplificação do padrão 2 (usado como PC) e NTC para HBV e IC é mostrado na Figura 2. A Figura 3 mostra as curvas de amplificação para uma amostra positiva para HBV, uma amostra negativa para HBV e uma amostra com inibição da PCR. A curva de amplificação, o valor de Ct...

Discussão

O código NIBSC 10/266 recebeu uma unidade de 9,55.000 UI/mL quando reconstituída em 0,5 mL de água livre de nucleases, de acordo com as informações do fornecedor²¹. Esta pode ser considerada uma amostra positiva para VHB de alta carga. A carga viral do VHB determinada pelo kit de carga viral utilizado neste estudo foi de 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Como a eficiência de extração de DNA de qualquer kit de extração de DNA não é de 100%, parte do DNA é frequen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198