B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 중합효소 연쇄 반응 기반 검출 및 정량

요약

B형 간염 바이러스(HBV) DNA의 실시간 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 검출 및 정량화는 B형 간염 바이러스 감염을 진단하고 모니터링하기 위한 민감하고 정확한 방법입니다. 여기에서는 HBV DNA 검출 및 샘플의 바이러스 부하 측정을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

B형 간염 바이러스(HBV)는 전 세계적으로 간 질환의 중요한 원인입니다. 급성 또는 만성 감염으로 이어질 수 있어 치명적인 간경변과 간암에 매우 취약합니다. 혈액 내 HBV DNA의 정확한 검출 및 정량화는 HBV 감염을 진단하고 모니터링하는 데 필수적입니다. HBV DNA를 검출하는 가장 일반적인 방법은 Real-Time PCR로, 바이러스를 검출하고 바이러스 부하를 평가하여 항바이러스 요법에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 IVD 마킹 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 키트는 HBV 게놈의 고도로 보존된 핵심 영역을 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하며 모든 HBV 유전자형(A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J)을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 키트에는 가능한 PCR 억제를 모니터링하기 위한 내인성 내부 대조군도 포함되어 있습니다. 이 분석은 40 사이클 동안 실행되며 컷오프는 38 Ct입니다. 임상 샘플에서 HBV DNA의 정량을 위해 5가지 정량 표준물질 세트가 키트와 함께 제공됩니다. 이 표준물질에는 핵산 검사를 위한 HBV DNA에 대한 4^번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA의 알려진 농도가 포함되어 있습니다. 이 표준물질은 HBV 특이적 DNA 증폭의 기능을 검증하고 표준 곡선을 생성하는 데 사용되며, 이를 통해 샘플에서 HBV DNA를 정량화할 수 있습니다. PCR 키트를 사용하여 2.5IU/mL의 낮은 HBV DNA를 검출했습니다. 이 키트의 높은 감도와 재현성은 임상 실험실에서 강력한 도구가 되어 의료 전문가가 HBV 감염을 효과적으로 진단하고 관리하는 데 도움이 됩니다.

서문

B형 간염 바이러스(HBV)는 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus) 속과 헤파드나비리과(Hepadnaviridae family)¹에 속하는 부분 이중 가닥 DNA 바이러스입니다. 이는 평생 지속되는 만성 감염을 유발할 수 있으며, 간경변증과 간세포암으로 이어질 수 있다 ^2,3,4. 세계보건기구(WHO)에 따르면 2019년 약 2억 9,600만 명의 인구가 만성 B형 간염 감염을 앓고 있었으며 매년 150만 명이 새로 감염되었습니다⁵.

혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA의 식별 및 측정은 진행 중인 B형 간염 감염자를 검출하고, 항바이러스 치료의 효능을 평가하고, 치료 성공 확률을 예측하는 데 유용한 방법입니다 6,7,8,9,10,11. 높은 바이러스 양은 간경변 및 간암을 포함한 간 질환 진행 위험 증가와 관련이 있습니다^12,13. 따라서 바이러스 양을 정확하게 측정하는 것은 HBV 감염의 진행을 추적하고 치료에 관한 결정을 내리는 데 매우 중요합니다.

정량적 Real-Time PCR 분석은 기존 PCR 기술보다 더 높은 감도, 더 넓은 동적 범위 및 HBV DNA의 더 정확한 정량을 제공합니다 14,15,16,17. 혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA를 정량화하기 위한 여러 상용 Real-Time PCR 기반 분자 진단 키트가 시중에 나와 있습니다. 여기에서는 시판되는 IVD 표시 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 워크플로우를 설명합니다. 이 키트는 널리 사용되는^18,19, 저비용이지만 고감도 분석법이며, 그 성능 특성은 상업적으로 이용 가능한 다른 CE 마크 키트(들)¹⁸와 비슷합니다. HBV 표적 부위 증폭 외에도 내인성 내부 대조 유전자도 키트에 포함되어 샘플의 품질, 추출된 DNA의 품질, PCR 증폭 및 가능한 PCR 억제를 검증합니다.

프로토콜

이 연구는 인간 참가자나 임상 샘플을 포함하지 않았습니다. 유일하게 사용된 생물학적 물질은 핵산 검사용 HBV DNA에 대한 4^번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)이었습니다. 이 표준은 개인 정보나 식별 가능한 데이터를 포함하지 않는 공개적으로 사용 가능한 참조 자료입니다. 따라서 이 연구에는 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.

1. DNA 추출

1. 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서 바이러스 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA를 PCR에서 추가로 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
   참고: DNA 추출을 위한 혈청 또는 혈장의 권장 부피는 500μL이고 용출량은 50μL입니다. 본 연구에서는 바이러스 핵산 추출 키트(Table of Materials)를 이용하여 바이러스 DNA를 추출하였다.

2. Real-time PCR

1. PCR을 시작하기 전에 Real-Time PCR 키트의 모든 시약(표 1)을 실온(RT, 15-25°C)에서 해동합니다. 해동되면 적당한 속도로 10초 동안 펄스 와류로 구성 요소를 혼합하고 RT에서 15초 동안 8,000× g 에서 원심분리기로 구성 요소를 혼합합니다. 해동된 모든 구성 요소를 냉각 블록에 보관합니다.
2. 반응 준비
   1. 표 2에 따라 PCR 혼합물을 준비한다. 시료 수, 표준물질 및 템플릿 대조군 없음을 기준으로 추가할 시약의 부피를 계산합니다.
      참고: PCR 혼합물을 준비할 때 각 시약의 최소 10% 추가 부피를 추가해야 합니다(예: 10회 반응이 필요한 경우 11회 반응으로 계산).
   2. 위에서 준비한 PCR 혼합물 15μL를 각 PCR 튜브에 피펫합니다. 그런 다음 추출된 샘플 DNA 15μL를 추가합니다. HBV DNA 검출을 위한 양성 대조군(PC)으로 HBV 표준물질(HBV Standard 1-5) 중 하나 이상의 15μL를 추가하고 음성 대조군(NC)으로 PCR 등급 뉴클레아제가 없는 물 15μL를 추가합니다. HBV DNA의 정량 분석에 필요한 표준 곡선을 생성하기 위해, 각 PCR 실행에 대해 키트와 함께 제공된 5가지 정량 표준물질(HBV 표준물질 1-5)을 모두 사용하십시오.
   3. 튜브를 닫고, 적당한 속도로 10초 동안 펄스 와류로 구성 요소를 혼합하고, 열 순환기로 진행하기 전에 RT에서 15초 동안 8,000× g 으로 원심분리합니다. 형광 검출을 방해할 수 있으므로 반응 혼합물에 기포가 없는지 확인하십시오.
3. 프로그램 설정
   1. 표 3에서 권장하는 대로 순환 조건을 사용하여 열 순환기를 프로그래밍합니다.
4. 채널/형광단 선택
   1. 표 4에 언급된 바와 같이 일반적으로 사용되는 Real-Time PCR 플랫폼에 사용할 형광 염료를 선택하십시오.
5. 데이터 분석
   1. 실행이 완료되면 선형 스케일에서 증폭 플롯을 분석합니다.
   2. 임계값 설정
      1. PCR 반응의 지수 단계 내에서 임계값을 설정합니다. 키트의 권장 임계값은 표 5에 언급되어 있습니다. 임계값 설정과 일관성을 유지합니다. 분석을 위한 최적의 임계값이 결정되면 특정 PCR 기계의 모든 샘플에 일관되게 사용합니다. 이렇게 하면 결과가 정확하고 재현 가능한지 확인하는 데 도움이 됩니다.
         알림: 임계값을 너무 낮게 설정하면 신호가 노이즈 수준보다 낮을 수 있으며 Ct 값을 신뢰할 수 없습니다. 임계값이 너무 높게 설정되면 신호는 증폭이 효율적이지 않고 Ct 값이 부정확할 수 있는 반응의 안정기에 있을 수 있습니다.
   3. 컷오프
      1. 40회 증폭 주기 동안 키트를 실행합니다. 어떤 해석을 위해 38주기를 초과하는 증폭을 고려하지 마십시오.
   4. 정성적 결과 분석
      1. HBV DNA의 정성적 검출을 위해 키트를 사용하십시오. HBV의 경우 20 ± 2, IC의 경우 24 ± 3의 예상 Ct 값을 가진 PC로 표준 2를 사용하십시오.
      2. 템플릿 제어(NTC)가 HBV 및 내부 제어(IC) 대상 모두에 대해 증폭을 나타내지 않는지 확인합니다. NTC 반응에서 증폭 반응이 발생하면 샘플 오염이 발생했을 수 있습니다.
      3. 분석 컷오프가 38이므로 HBV 표적에 대해 38Ct 이전의 증폭을 HBV 양성 샘플로 고려하십시오. 모든 대조군이 위에서 언급한 요구 사항을 충족하는 경우 표 6에 언급된 해석에 따라 표본을 고려하십시오.
   5. 정량적 결과 분석
      1. 핵산 증폭 기술(^NAT)을 위한 HBV DNA에 대한 4차 WHO 국제 표준에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA에 대해 알려진 농도의 5가지 정량 표준물질 세트를 사용합니다(표 7).
      2. 이러한 표준을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선을 활용하여 알려지지 않은 샘플의 HBV DNA를 정량화합니다.
         참고: Real-Time PCR 소프트웨어는 5가지 표준물질 모두의 HBV 표적에 대해 얻은 Ct 값과 마이크로리터당 국제 단위(IU/μL)의 해당 농도를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다.
      3. 표준물질의 기울기가 -3.1에서 -3.6 사이이고,^R2 값이 0.99에서 1.0 사이이고, PCR 효율이 90%-110%(0.9-1.1)이고, 음성 대조군에서 증폭이 없는 경우에만 알려지지 않은 샘플에 대한 값을 해석합니다.
      4. 이 소프트웨어는 각 HBV 양성 샘플의 농도를 마이크로리터당 국제 단위(IU/μL)로 계산합니다. 바이러스 부하(IU/μL를 밀리리터당 국제 단위[IU/mL]로 변환)를 계산하려면 다음 방정식을 사용합니다.
         결과(IU/mL) = (결과[IU/μL] x 용리 부피[μL])/ 시료 부피(mL)
         참고: HBV DNA에 대한 4^번째 WHO 국제 표준인 NIBSC 코드 10/266은 0.5mL 혈장에서 바이러스 DNA 정제를 위해 추출하고, 정제된 바이러스 DNA를 50μL의 용출 완충액으로 용출한 후 5가지 HBV 표준물질 및 NTC와 함께 PCR 키트와 함께 참조 샘플로 사용했습니다. 참조 샘플(NIBSC 코드 10/266)의 HBV 바이러스 양은 (6659IU/μL x 50μL)/0.5mL = 6,65,900IU/mL로 계산되었습니다.

결과

인간 혈장/혈청에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 워크플로우의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. HBV와 IC에 대한 표준 2(PC로 사용됨) 및 NTC의 증폭 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. 그림 3 은 HBV 양성 검체, HBV 음성 검체 및 PCR 억제 검체의 증폭 곡선을 보여줍니다. NIBSC 코드 10/266에 대한 증폭 곡선, HBV에 대한 Ct 값 및 마이크?...

토론

NIBSC 코드 10/266은 공급업체 정보²¹에 따라 0.5mL의 뉴클레아제가 없는 물에서 재구성할 때 9,55,000IU/mL의 단위가 할당되었습니다. 이것은 고부하 HBV 양성 샘플로 간주될 수 있습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 부하 키트로 측정된 HBV 바이러스 양은 6,65,900IU/mL였습니다(그림 4). DNA 추출 키트의 DNA 추출 효율이 100%가 아니기 때문에 정제 과정에서 일부 DNA가 손실?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198