זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת של DNA של נגיף הפטיטיס B

Summary

זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) של DNA של נגיף הפטיטיס B (HBV) היא שיטה רגישה ומדויקת לאבחון וניטור זיהום HBV. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי DNA HBV ומדידת עומס נגיפי של דגימה.

Abstract

נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא גורם משמעותי למחלות כבד ברחבי העולם. זה יכול להוביל לזיהומים חריפים או כרוניים, מה שהופך אנשים רגישים מאוד שחמת קטלנית וסרטן הכבד. זיהוי וכימות מדויקים של DNA HBV בדם חיוניים לאבחון וניטור זיהום HBV. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי DNA HBV היא PCR בזמן אמת, אשר ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הנגיף ולהעריך את העומס הנגיפי כדי לפקח על התגובה לטיפול אנטי ויראלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או פלזמה באמצעות ערכה מבוססת PCR בזמן אמת המסומנת IVD. הערכה משתמשת בפריימרים ובבדיקות המכוונים לאזור הליבה השמור ביותר של גנום HBV ויכולים לכמת במדויק את כל הגנוטיפים של HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I ו-J). הערכה כוללת גם בקרה פנימית אנדוגנית לניטור עיכוב PCR אפשרי. בדיקה זו נמשכת 40 מחזורים, והחיתוך שלה הוא 38 Ct. לכימות DNA HBV בדגימות קליניות, מסופקת ערכה של 5 תקני כימות עם הערכה. התקנים מכילים ריכוזים ידועים של DNA ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומי^{הרביעי של} ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). התקנים משמשים לאימות הפונקציונליות של הגברה ספציפית ל- HBV DNA וליצירת עקומה סטנדרטית, המאפשרת לכמת DNA HBV בדגימה. DNA HBV נמוך של 2.5IU/mL זוהה באמצעות ערכת PCR. הרגישות הגבוהה ויכולת השחזור של הערכה הופכות אותה לכלי רב עוצמה במעבדות קליניות, ומסייעת לאנשי מקצוע בתחום הבריאות באבחון וניהול יעיל של זיהומי HBV.

Introduction

נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא נגיף DNA דו-גדילי חלקית מהסוג Orthohepadnavirus וממשפחת Hepadnaviridae ¹. זה יכול לעורר זיהום כרוני שנמשך לאורך כל החיים, מה שעלול להוביל שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular ^2,3,4. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), אוכלוסייה מוערכת של 296 מיליון אנשים חיו עם זיהום כרוני הפטיטיס B בשנת 2019, ו -1.5 מיליון אנשים נדבקו חדשים מדי שנה⁵.

זיהוי ומדידה של DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה משמשים כשיטה רבת ערך לאיתור אנשים עם זיהום מתמשך בהפטיטיס B, הערכת יעילות הטיפול האנטי-ויראלי וחיזוי ההסתברות להצלחת הטיפול 6,7,8,9,10,11. עומס נגיפי גבוה קשור לסיכון מוגבר להתקדמות מחלות כבד, כולל שחמת הכבד וסרטן הכבד^12,13. לפיכך, מדידה מדויקת של עומס נגיפי היא חיונית למעקב אחר התקדמות זיהום HBV ולקבלת החלטות לגבי הטיפול.

לבדיקות PCR כמותיות בזמן אמת יש רגישות גבוהה יותר, טווח דינמי רחב יותר וכימות מדויק יותר של DNA HBV מאשר טכניקות PCR קונבנציונליות 14,15,16,17. מספר ערכות אבחון מולקולריות מסחריות בזמן אמת מבוססות PCR לכימות DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה זמינות בשוק. במאמר זה אנו מתארים תהליך עבודה מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או בפלזמה באמצעות ערכה מסחרית זמינה מסחרית המבוססת על PCR בזמן אמת. הערכה נמצאת בשימוש נרחב^18,19, בעלות נמוכה אך רגישה מאוד, ומאפייני הביצועים שלה דומים לערכות אחרות הזמינות מסחרית עם סימון ^CE18. מלבד הגברה של אזור היעד HBV, גן בקרה פנימית אנדוגני כלול גם בערכה כדי לאמת את איכות הדגימות, איכות ה- DNA שחולץ, הגברת PCR ועיכוב PCR אפשרי.

Protocol

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים או דגימות קליניות. החומר הביולוגי היחיד ששימש היה התקן הבינלאומי^{הרביעי של} ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). תקן זה הוא חומר עזר הזמין לציבור ואינו מכיל מידע אישי או נתונים הניתנים לזיהוי. כיוון שכך, לא נדרש אישור אתי למחקר זה.

1. מיצוי DNA

1. חלצו את הדנ"א הנגיפי מסרום אנושי או מדגימת פלזמה. אחסן את ה- DNA שחולץ ב -20 ° C עד לשימוש נוסף ב- PCR.
   הערה: הנפח המומלץ של סרום או פלזמה למיצוי DNA הוא 500 μL, ונפח elution הוא 50 μL. במחקר זה, הדנ"א הנגיפי הופק באמצעות ערכה למיצוי חומצות גרעין נגיפיות (Table of Materials).

2. PCR בזמן אמת

1. הפשירו את כל הריאגנטים (טבלה 1) של ערכת ה-PCR בזמן אמת בטמפרטורת החדר (RT; 15-25°C) לפני תחילת בדיקת ה-PCR. לאחר ההפשרה, ערבבו את הרכיבים על ידי מערבולות פולס במשך 10 שניות במהירות בינונית וצנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 שניות ב- RT. שמרו את כל הרכיבים המופשרים על בלוק קירור.
2. הכנת תגובה
   1. הכינו תערובת PCR לפי טבלה 2. חשב את נפח הריאגנטים שיש להוסיף בהתבסס על מספר הדגימות, התקנים וללא בקרת תבנית.
      הערה: בעת הכנת תערובת PCR, יש להוסיף לפחות 10% נפח נוסף של כל מגיב (למשל, אם נדרשות 10 תגובות, חשב עבור 11 תגובות).
   2. Pipet 15 μL של תערובת PCR שהוכן לעיל לתוך כל צינור PCR. לאחר מכן, הוסף 15 μL של DNA הדגימה שחולץ. הוסף 15 μL של לפחות אחד התקנים עבור HBV (תקן HBV 1-5) כבקרה חיובית (PC) לגילוי DNA HBV ו- 15 μL של מים נטולי נוקלאז ברמת PCR כבקרה שלילית (NC). כדי ליצור עקומה סטנדרטית הנדרשת לכימות הדנ"א של HBV, השתמש בכל 5 תקני הכימות שסופקו עם הערכה (תקן HBV 1-5) עבור כל ריצת PCR.
   3. סגור את הצינורות, מערבב את הרכיבים על ידי מערבולת פולס במשך 10 שניות במהירות בינונית, וצנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 שניות ב- RT לפני שתמשיך למחזור התרמי. ודא שאין בועות בתמהיל התגובה, מכיוון שהוא עלול להפריע לזיהוי פלואורסצנטי.
3. הגדרת התוכנית
   1. תכנת את המחזור התרמי לפי תנאי הרכיבה כמומלץ בטבלה 3.
4. בחירת ערוץ/פלואורופור
   1. בחר את הצבעים הפלואורסצנטיים עבור פלטפורמות PCR נפוצות בזמן אמת, כפי שמוזכר בטבלה 4.
5. ניתוח נתונים
   1. לאחר השלמת הריצה, נתח את תרשים ההגברה בקנה מידה ליניארי.
   2. הגדרת סף
      1. הגדר את הסף בתוך השלב המעריכי של תגובת PCR. ערכי סף מומלצים עבור הערכה מוזכרים בטבלה 5. היו עקביים עם הגדרת הסף. לאחר קביעת הסף האופטימלי לבדיקה, השתמש בו באופן עקבי עבור כל הדגימות עבור מכשיר PCR מסוים. זה יעזור להבטיח כי התוצאות מדויקות לשחזור.
         הערה: אם הסף מוגדר נמוך מדי, ייתכן שהאות נמוך מרמת הרעש וערך ה- Ct לא יהיה אמין. אם הסף מוגדר גבוה מדי, האות עשוי להיות בשלב המישור של התגובה, שבו ההגברה אינה יעילה, וערך ה- Ct עשוי להיות לא מדויק.
   3. חיתוך
      1. הפעל את הערכה במשך 40 מחזורי הגברה. אין להתייחס לשום הגברה מעבר ל-38 מחזורים לכל פרשנות.
   4. ניתוח תוצאות איכותי
      1. השתמש בערכה לזיהוי איכותי של DNA HBV. השתמש בתקן 2 כמחשב עם ערכי Ct צפויים של 20 ± 2 עבור HBV ו- 24 ± 3 עבור IC.
      2. ודא שאף פקד תבנית (NTC) אינו מציג הגברה הן עבור HBV והן עבור מטרות בקרה פנימית (IC). אם מתרחשת תגובת הגברה בתגובת NTC, ייתכן שהתרחש זיהום דגימה.
      3. מכיוון שסף הבדיקה הוא 38, שקול כל הגברה לפני 38 Ct עבור יעד HBV כמדגם חיובי ל- HBV. כאשר כל הבקרות עומדות בדרישות שצוינו לעיל, שקול דגימה בהתאם לפרשנויות המוזכרות בטבלה 6.
   5. ניתוח תוצאות כמותי
      1. השתמש בקבוצה של 5 תקני כימות של ריכוזים ידועים עבור דנ"א ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומי הרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA עבור טכניקות הגברה של חומצות גרעין (NAT)²⁰ (טבלה 7).
      2. השתמש בתקנים אלה כדי ליצור עקומת תקן. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לכמת את הדנ"א HBV של דגימה לא ידועה.
         הערה: תוכנת ה-PCR בזמן אמת תיצור עקומה סטנדרטית באמצעות ערכי Ct המתקבלים עבור יעדי HBV של כל 5 התקנים והריכוזים המתאימים להם ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL).
      3. לפרש את הערכים עבור דגימות לא ידועות רק אם שיפוע התקנים נופל בין -3.1 ל -3.6, ערך R² הוא בין 0.99 ל -1.0, יעילות PCR היא בין 90%-110% (0.9-1.1), ואין הגברה בבקרה השלילית.
      4. התוכנה תחשב את הריכוז של כל דגימה חיובית HBV ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL). כדי לחשב את העומס הנגיפי (המרה של IU/μL ליחידות בינלאומיות למיליליטר [IU/mL]), השתמש במשוואה הבאה:
         תוצאה (IU/mL) = (תוצאה [IU/μL] x נפח Elution [μL])/ נפח דגימה (mL)
         הערה: התקן הבינלאומי^{הרביעי של} ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA, NIBSC code 10/266, הופק לטיהור DNA נגיפי מפלזמה של 0.5 מ"ל, דילל את ה- DNA הנגיפי המטוהר ל- 50 μL של מאגר אלוציה ושימש עם ערכת ה- PCR כדגימת ייחוס יחד עם 5 תקני HBV ו- NTC. העומס הנגיפי HBV של דגימת הייחוס (קוד NIBSC 10/266) חושב כ- (6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 מ"ל = 6,65,900 IU/mL.

תוצאות

דיאגרמה סכמטית של תהליך העבודה לזיהוי וכימות דנ"א HBV מפלזמה/סרום אנושי מוצגת באיור 1. תרשים הגברה של תקן 2 (המשמש כמחשב) ו-NTC עבור HBV ו-IC מוצג באיור 2. איור 3 מראה את עקומות ההגברה עבור דגימה חיובית ל-HBV, דגימה שלילית ל-HBV ודגימה עם עיכוב PCR. עקומת ההג...

Discussion

קוד NIBSC 10/266 הוקצה ליחידה של 9,55,000 IU/mL כאשר הוא מורכב מחדש ב- 0.5 מ"ל של מים ללא Nuclease בהתאם למידע הספק²¹. זה יכול להיחשב מדגם חיובי HBV עומס גבוה. העומס הנגיפי של HBV שנקבע על-ידי ערכת העומס הנגיפי ששימשה במחקר זה היה 6,65,900 IU/mL (איור 4). מכיוון שיעילות מיצוי הדנ"א של כל ערכת מי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198