Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de evolución experimental para la adaptación en termófilos utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética como incubadoras. La técnica se demuestra a través de la caracterización de la adaptación a la temperatura en Sulfolobus acidocaldarius, una arquea con una temperatura óptima de crecimiento de 75 °C.

Resumen

El arqueo Sulfolobus acidocaldarius ha surgido como un prometedor sistema modelo termófilo. Investigar cómo los termófilos se adaptan a los cambios de temperatura es un requisito clave, no solo para comprender los procesos evolutivos fundamentales, sino también para desarrollar S. acidocaldarius como chasis para la bioingeniería. Un obstáculo importante para llevar a cabo la evolución experimental con termófilos es el costo del mantenimiento del equipo y el uso de energía de las incubadoras tradicionales para el crecimiento a alta temperatura. Para abordar este desafío, se presenta un protocolo experimental integral para llevar a cabo la evolución experimental en S. acidocaldarius, utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética. El protocolo implica una técnica de cultivo por lotes con volúmenes relativamente pequeños (1,5 mL), lo que permite el seguimiento de la adaptación en múltiples linajes independientes. Este método es fácilmente escalable mediante el uso de termomezcladores adicionales. Este enfoque aumenta la accesibilidad de S. acidocaldarius como sistema modelo al reducir tanto la inversión inicial como los costos continuos asociados con las investigaciones experimentales. Además, la técnica es transferible a otros sistemas microbianos para explorar la adaptación a diversas condiciones ambientales.

Introducción

La vida primitiva en la Tierra puede haberse originado en ambientes extremos, como los respiraderos hidrotermales, que se caracterizan por temperaturas y acidez extremadamente^altas. Los microbios continúan habitando en ambientes extremos, incluyendo aguas termales y solfatara volcánica. La caracterización de la dinámica evolutiva que ocurre en estas condiciones extremas puede arrojar luz sobre los procesos fisiológicos especializados que permiten la supervivencia en estas condiciones. Esto puede tener implicaciones de gran alcance, desde nuestra comprensión de los orígenes de la diversidad biológica hasta el desarrollo de nuevas enzimas de alta temperatura con aplicaciones biotecnológicas.

La comprensión de la dinámica evolutiva microbiana en entornos extremos sigue siendo limitada a pesar de su importancia crítica. Por el contrario, se ha adquirido un importante cuerpo de conocimientos sobre la evolución en ambientes mesófilos mediante la aplicación de una técnica conocida como evolución experimental. La evolución experimental implica observar el cambio evolutivo en condiciones de laboratorio 2,3,4,5. A menudo, esto implica un entorno de cambio definido (por ejemplo, temperatura, salinidad, introducción de una toxina o un organismo competidor)^7,8,9. Cuando se combina con la secuenciación del genoma completo, la evolución experimental nos ha permitido probar aspectos clave de los procesos evolutivos, incluido el paralelismo, la repetibilidad y la base genómica para la adaptación. Sin embargo, hasta la fecha, la mayor parte de la evolución experimental se ha realizado con microbios mesófilos (incluyendo bacterias, hongos y virus 2,3,4,5, pero excluyendo en gran medida las arqueas). Un método de evolución experimental aplicable a los microbios termófilos nos permitiría comprender mejor cómo evolucionan y contribuiría a una comprensión más completa de la evolución. Esto tiene implicaciones potencialmente de gran alcance, desde descifrar los orígenes de la vida termófila en la Tierra hasta aplicaciones biotecnológicas que involucran "extremozimas" utilizadas en bioprocesos de alta temperatura¹⁰ e investigación astrobiológica¹¹.

La arquea Sulfolobus acidocaldarius es un candidato ideal como organismo modelo para el desarrollo de técnicas experimentales de evolución para termófilos. S. acidocaldarius se reproduce aeróbicamente, con una temperatura óptima de crecimiento a 75 °C (rango de 55 °C a 85 °C) y alta acidez (pH 2-3)4,6,12,13,14. Sorprendentemente, a pesar de sus condiciones extremas de crecimiento, S. acidocaldarius mantiene densidades de población y tasas de mutación comparables a las de los mesófilos 7,15,16,17,18. Además, posee un genoma relativamente pequeño y bien anotado (cepa DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 genes)¹²; S. acidocaldarius también se beneficia de sólidas herramientas de ingeniería genómica, que permiten una evaluación directa del proceso evolutivo a través de knockouts de genes específicos¹⁹. Un ejemplo notable de esto es la disponibilidad de cepas genéticamente modificadas de S. acidocaldarius, como las cepas auxotróficas de uracilo de MW001¹⁹ y SK-1²⁰, que pueden servir como marcadores seleccionables.

Existen desafíos significativos con la realización de la evolución experimental con termófilos como S. acidocaldarius. La incubación prolongada a altas temperaturas requerida para estos estudios impone una evaporación considerable para las técnicas de cultivo tanto líquidas como sólidas. El funcionamiento prolongado a altas temperaturas también puede dañar las incubadoras de agitación tradicionales que se utilizan habitualmente en la evolución experimental en medios líquidos. La exploración de múltiples temperaturas requiere una inversión financiera sustancial para adquirir y mantener varias incubadoras. Además, el alto consumo de energía requerido plantea importantes preocupaciones ambientales y financieras.

Este trabajo presenta un método para abordar los desafíos encontrados en la realización de la evolución experimental con termófilos como S. acidocaldarius. Basándose en una técnica desarrollada por Baes et al. para investigar la respuesta al choque térmico^14,21, el método desarrollado aquí utiliza termomezcladores de sobremesa para una incubación consistente y confiable a alta temperatura. Su escalabilidad permite la evaluación simultánea de múltiples tratamientos de temperatura, con costos reducidos en la adquisición de equipos de incubación adicionales. Esto mejora la eficiencia experimental, permitiendo un análisis estadístico robusto y una investigación exhaustiva de los factores que influyen en la dinámica evolutiva de los termófilos²². Además, este enfoque reduce significativamente la inversión financiera inicial y el consumo de energía en comparación con las incubadoras tradicionales, ofreciendo una alternativa más sostenible y respetuosa con el medio ambiente.

Nuestro método sienta las bases para investigar experimentalmente la dinámica evolutiva en entornos caracterizados por temperaturas extremas, que pueden haber desempeñado un papel clave durante las primeras etapas de la diversificación de la vida en la Tierra. Los organismos termófilos tienen propiedades únicas, pero sus condiciones extremas de crecimiento y requisitos especializados a menudo han limitado su accesibilidad como sistema modelo. La superación de estas barreras no solo amplía las oportunidades de investigación para investigar la dinámica evolutiva, sino que también mejora la utilidad más amplia de los termófilos como sistemas modelo en la investigación científica.

Protocolo

1. Preparación del medio de crecimiento de S. acidocaldarius (BBM⁺)

NOTA: Para cultivar S. acidocaldarius, este protocolo utiliza Basal Brock Medium (BBM⁺)²³. Esto se prepara combinando primero las soluciones madre inorgánicas que se describen a continuación para crear BBM^-, que se puede preparar con anticipación. A continuación, BBM⁺ se prepara según sea necesario añadiendo las soluciones madre orgánicas a BBM⁻. Las recetas de soluciones madre también se presentan en la Tabla 1. Todos los medios y soluciones madre deben prepararse en H₂O (ddH₂O) de doble destilación.

1. Preparación de soluciones madre inorgánicas para el medio de crecimiento
   1. Prepare la solución madre de oligoelementos.
      1. Prepare la solución madre de oligoelementos añadiendo 9 g/L de tetraborato de sodio decahidratado (Na₂B₄O₇·10H₂O) a ddH₂O, seguido de la adición de 1:1 H₂SO₄ gota a gota hasta que se haya disuelto.
      2. Introducir secuencialmente 0,44 g/L de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO_{4,7H 2}O), 0,1 g/L de cloruro de cobre (II) dihidratado (CuCl 2,2H₂O), 0,06 g/L de molibdato sódico dihidratado (Na₂MoO_{4,2H 2}O), 0,06 g/L de sulfato de vanadio (IV) dihidratado (VOSO_{4,2H 2}O), 0,02 g/L de sulfato de cobalto (II) heptahidratado (CoSO_{4,7H 2}O), y 3,6 g/L de cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl₂·4H₂O). Esterilizar la solución en autoclave y almacenar a 4 °C.
   2. Preparar la solución madre de Fe (1000x) disolviendo 20 g/L de cloruro férrico hexahidratado (FeCl₃·6H₂O) en ddH₂O. Esterilizar la solución filtrándola a través de un filtro de 0,22 μm y almacenarla a 4 °C.
   3. Prepare la solución Brock I (1000x) disolviendo 70 g/L de cloruro de calcio (CaCl₂·2H₂O) en agua bidestilada (ddH₂O). Autoclave y almacenar a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: La disolución de CaCl₂·2H₂O en agua es un proceso exotérmico. Realice este paso con cuidado. Use guantes de riesgo térmico con clasificación EN407 para protegerse contra lesiones. No cierre herméticamente el recipiente, ya que puede acumularse presión.
   4. Prepare la solución Brock II/III combinando 130 g/L de sulfato de amonio ((NH₄)₂SO₄), 25 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO₄·7H₂O), 28 g/L de fosfato de dihidrógeno potásico (KH₂PO₄) y 50 mL de la solución madre de oligoelementos previamente preparada. Usando 1:1 H₂SO₄, ajuste el pH de la solución madre a 2-3. Esterilizar la solución en autoclave y almacenarla a temperatura ambiente (RT).
2. Preparación de soluciones madre orgánicas para el medio de crecimiento
   1. Prepare la solución madre de D-glucosa (100x) disolviendo 300 g/L (30% p/v) de D-glucosa en ddH₂O y esterilize con filtro (a través de un filtro de 0,22 μm). Conservar a 4 °C.
      NOTA: Se pueden utilizar otras fuentes de carbono en lugar de la D-glucosa de acuerdo con los requisitos experimentales (por ejemplo, D-xilosa).
   2. Prepare la peptona a partir de la solución madre de caseína (100x) disolviendo la peptona de la caseína a 100 g/L en el autoclave ddH₂O. para esterilizar y almacenar la solución madre en RT.
   3. Preparar la solución madre de uracilo (100x) disolviendo 2 g/L de uracilo en ddH₂O y esterilizar con filtro (a través de un filtro de 0,22 μm); almacenar a -20 °C.
3. Preparación del medio de crecimiento BBM⁺ a una concentración de trabajo 1x
   1. En primer lugar, prepare 988 mL de ddH₂O estéril mediante autoclave.
   2. Prepare 1 L BBM⁻ añadiendo 1 mL de Brock Stock Solution I, 10 mL de Brock Stock Solution II/III y 1 mL de solución madre de Fe a los 988 mL de ddH₂O estéril esterilizado previamente en autoclave. Ajuste el pH del medio al rango de 2-3 con 1:1 H₂SO₄.
      NOTA: BBM⁻ se puede hacer por adelantado y almacenar en RT hasta por 1 mes.
   3. Por último, para producir 1 L de BBM⁺, combine 10 mL de solución madre de D-glucosa, 10 ml de solución madre de peptona de caseína y solución madre de uracilo con 985 ml de BBM⁻. Mezclar bien y ajustar el pH del medio a 2-3 con 1:1 H₂SO₄.
      NOTA: BBM⁺ debe estar recién hecho según sea necesario.
4. Preparación del medio sólido BBM⁺
   1. Preparar soluciones madre 1 M de MgCl₂ y CaCl₂; estos ayudarán en la solidificación del medio sólido BBM. Para 1 M MgCl₂, añadir 9,5 g a 100 mL de ddH₂O. Para 1 M de CaCl₂, añadir 11 g a 100 mL de ddH₂O. Autoclave para esterilizar.
      PRECAUCIÓN: La disolución de CaCl₂·2H₂O en agua es un proceso exotérmico. Realice este paso con cuidado. Use guantes de riesgo térmico con clasificación EN407 para protegerse contra lesiones. No cierre herméticamente el recipiente, ya que puede acumularse presión.
   2. Mezcle un 3% (p/v) de goma gellan (por ejemplo, 30 g/L) en ddH₂O y autoclave para esterilizar.
      NOTA: La goma gellan (por ejemplo, gelrita) se utiliza aquí como agente gelificante, ya que el agar bacteriológico estándar no puede solidificarse a 75 °C.
   3. Por separado, prepare BBM⁺ para el medio sólido, que se mezclará en una proporción de 1:1 con la goma gellan estéril preparada en el paso 1.4.1.
      1. Primero, prepare 1 L BBM⁻ como en el paso 1.3.2. Combine 887 mL de BBM⁻ con 1 mL de solución madre de Fe y 20 ml de solución madre de D-glucosa, solución madre de peptona de caseína y solución madre de uracilo.
      2. Añadir 40 mL de 1 M MgCl₂ y 12 mL de 1 M CaCl₂. Mezclar bien y ajustar el pH del medio a 2-3 con 1:1 H₂SO₄.
         NOTA: Los volúmenes de soluciones madre añadidos aquí son intencionadamente mayores que los de la preparación de BBM⁺ líquido en el paso 1.3. Esto es para tener en cuenta la mezcla en una proporción de 1:1 con goma gellan fundida en el siguiente paso.
   4. Precaliente el BBM⁺ para un medio sólido a aproximadamente 75 °C y mezcle en una proporción de 1:1 con goma gellan fundida en ddH₂O. Mezcle bien y vierta en plástico termoestable (por ejemplo, polipropileno), placas de Petri de vidrio o placas de seis pocillos para el crecimiento deS. acidocaldarius. Use el agar inmediatamente una vez mezclado, ya que se endurecerá rápidamente.
      NOTA: Algunas placas de Petri de poliestireno de 90 mm comúnmente utilizadas para microbiología se deformarán si se incuban a altas temperaturas durante períodos prolongados.
      PRECAUCIÓN: Tome las precauciones de seguridad adecuadas cuando trate con líquidos calientes; use guantes de riesgo térmico con clasificación EN407 para protegerse contra lesiones.

2. Revivir S. acidocaldarius de un cultivo de stock congelado

1. Preparación de tubos de crecimiento ventilados para asegurar una aireación suficiente y disponibilidad de oxígeno.
   1. Con anticipación, prepare tubos de microcentrífuga perforados de 2 mL para el crecimiento de Sulfolobus . Caliente con cuidado un alambre romo (>0,7 mm, como un clip enderezado) con la llama de un mechero Bunsen y perfore la tapa del tubo, creando un pequeño agujero de aproximadamente 1 mm.
   2. Coloque los tubos perforados en un recipiente esterilizable en autoclave (p. ej., caja de puntas de pipeta vacía) y autoclave para esterilizar.
      PRECAUCIÓN: Use guantes de riesgo térmico con clasificación EN407 para protegerse contra lesiones térmicas en las manos por metal caliente. Caliente el cable solo por un corto tiempo (1-2 s) para evitar el sobrecalentamiento. Solo se deben utilizar metales con una alta temperatura de fusión (acero).
2. Inocular cultivos iniciadores de S. acidocaldarius.
   1. Llene los tubos perforados de 2 ml esterilizados en autoclave con 1,5 ml de BBM⁺ precalentado (tal como se preparó en la sección 1, preincubado a 75 °C durante al menos 15 min).
   2. Inocular los tubos rellenos de BBM⁺ con un raspado (equivalente a 50 - 60 mg) de un caldo de glicerol (25% v/v de glicerol, almacenado a -80 °C). En este caso, se utiliza la cepa DSM639 de S. acidocaldarius . Llene un tubo adicional con 1,5 mL de BBM+ como control negativo.
3. Para evitar que los aerosoles se escapen de la tapa perforada del tubo de 2 ml y contaminen el entorno de crecimiento (y cualquier otra muestra) y para reducir la variabilidad de la evaporación del cultivo dentro de los tubos, coloque una membrana permeable al gas en la parte superior de la tapa que pueda soportar temperaturas elevadas (65-85 °C) y bloquear el escape/infiltración microbiana.
   NOTA: La utilización de membranas permeables al gas para sellar los tubos reduce considerablemente la evaporación. Durante un período de 48 h a 75 °C, los tubos sellados presentan una pérdida de volumen promedio de 8.63% (rango: 3.29-16.45%, n = 24 réplicas técnicas, repetidas dos veces), en contraste con 25.05% (rango: 11.92-62.91%, n = 24 réplicas técnicas, repetidas dos veces) para tubos no sellados.
4. Incubar los tubos inoculados en un termomezclador a 75 °C con agitación constante a 400 revoluciones por minuto (RPM) durante 48-72 h o hasta alcanzar un diámetro exterior de_{600 nm} de 0,3 a 0,8 medido por espectrofotómetro.
   NOTA: La tapa perforada de los tubos de 2 mL y la agitación permiten una aireación adecuada para un crecimiento óptimo. La tapa de la termobatidora debe estar en su lugar para garantizar que se mantenga una temperatura constante y para reducir la evaporación.
5. Después del período de incubación, dé a los cultivos revividos una segunda fase de crecimiento (preacondicionamiento).
   1. Granular los cultivos girando los tubos a 5000 x g durante 2 min a RT. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en BBM⁺ fresco de 1,5 mL tibio.
      NOTA: Este experimento utiliza la cepa de tipo salvaje DSM639 de S. acidocaldarius , pero estos métodos de crecimiento y evolución experimental se pueden aplicar a cualquier cepa de Sulfolobus y potencialmente a otros termófilos.

3. Determinación de la densidad poblacional, el tiempo de duplicación y la fase de crecimiento exponencial de S. acidocaldarius

1. Determine la densidad poblacional y el tiempo hasta la fase de crecimiento exponencial para las condiciones de selección elegidas. Para cada condición ambiental que se va a probar, prepare tres cultivos iniciadores siguiendo los pasos 2.1-2.5.
2. Diluya los tres cultivos en BBM⁺ hasta un diámetro exterior de_{600 nm} de 0,01. Prepare al menos 20 ml de cada cultivo. Estas tres culturas representan réplicas técnicas.
3. Realice curvas de crecimiento replicadas de OD_{600 nm} a lo largo del tiempo utilizando muestreo destructivo.
   1. Prepare 24 tubos perforados de 2 ml del paso 2.1, sepárelos en tres juegos de ocho y etiquete estas réplicas técnicas 1, 2 y 3 (por ejemplo, ocho tubos etiquetados como réplica 1, etc.).
   2. De cada uno de los tres cultivos diluidos del paso 3.2, pipetear 1,5 mL en siete tubos preparados. Llene el tubo restante con 1,5 ml de BBM+ como control negativo.
4. Incubar los 24 tubos en una termomezcladora a 75 °C y 400 RPM. Sellar con una membrana permeable al gas. A intervalos regulares (como 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 h), retire un tubo de cada una de las tres réplicas y mida el diámetro exterior de_{600 nm} con un espectrofotómetro, luego deseche el tubo. Reemplace la membrana permeable al gas después de quitar un tubo.
5. Paralelamente, determine la relación entre OD_600nm y la densidad de población. Realice diluciones en serie (1 x ^10-1 a 1 x ^10-6) en medio BBM⁺ durante al menos tres puntos de tiempo (idealmente, inicio, medio y final). Inocular 100 μL de cada dilución en medio sólido BBM⁺ (preparado como en el paso 1.4).
   NOTA: Para lograr un crecimiento constante de la colonia y recuentos precisos, es mejor pipetear el cultivo diluido en un medio sólido en un lugar sin realizar una distribución mecánica, como el uso de un esparcidor en forma de L o perlas de vidrio. La propagación mecánica parece tener un impacto adverso en la formación de colonias.
6. Incubar las placas en una incubadora estática a 75 °C hasta que aparezcan las colonias (5-7 días).
   1. Durante este período de tiempo, mantenga la incubadora húmeda para evitar un secado excesivo de las placas, o no se formarán colonias.
   2. Consíguelo colocando las placas en una caja cerrada de polipropileno forrada con un paño húmedo. Perfore la tapa de la caja al menos tres veces para permitir la aireación.
   3. Coloque cubos de agua en la incubadora para aumentar la humedad. Rellene los cubos a diario.
7. Una vez que se hayan recopilado todas las mediciones de OD_{600 nm} , determine el tiempo de duplicación y el tiempo para alcanzar la fase de crecimiento exponencial ajustando una curva logística a la relación entre OD_{600 nm} y el tiempo, por ejemplo, utilizando SummarizeGrowth del paquete growthcurver en R.
8. Una vez que se han formado colonias visibles en medios sólidos, cuente las unidades formadoras de colonias (UFC), con el objetivo de contar a partir del factor de dilución, produciendo de 50 a 100 colonias para obtener la mejor precisión.
9. Calcular la densidad celular en el medio de cultivo utilizando la fórmula: UFC/mL = número de colonias/(volumen sembrado × factor de dilución).
10. Realice una regresión lineal log-log para determinar la relación entre log10 (CFU) y log10 (OD_600nm). Por lo tanto, calcule la UFC/mL predicha para un OD dado a partir de la pendiente y la intersección del modelo de regresión: CFU predicha = 10 ^{[pendiente × log10 (OD600nm) + intersección]}.
11. (Opcional) Además, realice los pasos 3.1-3.10 en una incubadora agitadora para determinar si se está logrando un crecimiento comparable en los termomezcladores.

4. Inicio de linajes independientes para la evolución experimental

1. Día 1: Para generar colonias individuales, primero realice todos los pasos de la sección 2 anterior para generar una cultura inicial.
2. Día 3: Medir el diámetro exterior de_{600 nm} del cultivo para asegurarse de que ha alcanzado una densidad suficiente en la fase exponencial (diámetro exterior_{de 600 nm} 0,3-0,8 por espectrofotómetro).
3. Cree diluciones en serie del cultivo de S. acidocaldarius DSM639 a partir de 1 x ^10-1-1 x ^10-6 y extienda 100 μL de cada dilución de 1 x ^10-5 y 1 x ^10-6 en pocillos de una placa de 6 pocillos que contenga medio sólido BBM⁺ (Sección 1 y Tabla 1) en varias réplicas. Incubar las placas a 75 °C en una incubadora estática como en el paso 3.5 durante 5-7 días para que emerjan colonias individuales.
4. Día 8-10 (5-7 días después de la incubación):
   1. Establecer el número de linajes en evolución a partir de colonias individuales. Para cada linaje, elija una colonia al azar de las placas usando un circuito de inoculación. Vuelva a suspender la colonia en un tubo perforado de 2 mL que contenga 1,5 mL de medio BBM⁺ precalentado. Etiquete adecuadamente el tubo.
   2. Repita para el número deseado de linajes; aquí, se establecieron siete linajes y se etiquetaron como SA1-7. Llene un tubo adicional con 1,5 mL de BBM+ como control negativo.
   3. Sellar la parte superior de los tubos con una membrana transpirable e incubar en un termomezclador a 75 °C, 400 rpm durante 48-72 h, hasta que los cultivos se turbien (equivalente a_{OD 600nm} 0,3-0,8 por espectrofotómetro).
5. Día 10-12 (7-9 días después de la inoculación):
   1. En una centrífuga de sobremesa, centrifugar los cultivos clonales a 5.000 x g durante 1 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 200 μL de BBM⁺ líquido.
   2. Mezcle las suspensiones celulares de 200 μL con 200 μL de glicerol al 50% (25% v/v glicerol) para crear las reservas de glicerol de los siete linajes independientes y almacene a -80 °C. Estas son las poblaciones ancestrales para los experimentos de evolución.

5. Realización del experimento de evolución de la temperatura

NOTA: En la Figura 1 se presenta un diagrama conceptual que describe los aspectos principales del protocolo del experimento.

1. Utilice las siete poblaciones ancestrales generadas en la sección 4 para el experimento de evolución.
   1. Llevar a cabo todos los ensayos experimentales de evolución en tubos estériles perforados de 2 mL sellados con una membrana permeable (descrito anteriormente, sección 2).
   2. Junto a estas poblaciones, mantener tubos perforados separados de 2 mL con 1,5 mL de BBM⁺ como controles negativos libres de cultivo para monitorear la contaminación (cruzada) y establecer un umbral para el DO que indique que no hay crecimiento de cultivo.
2. Establecer tratamientos de temperatura: El uso de termomezcladores permite establecer múltiples tratamientos de temperatura. En este caso, utilice los siguientes tratamientos de temperatura: 75 °C constantes, 65 °C constantes y descenso gradual de 75 a 65 °C disminuyendo la temperatura en 1 °C cada 4 días («tratamiento de descenso de temperatura»).
   NOTA: Estos tratamientos se pueden adaptar a requisitos experimentales específicos. Se requiere un termomezclador separado para cada tratamiento de temperatura.
3. Día 1: Revivir las poblaciones ancestrales a partir de sus reservas de glicerol (preparado en el paso 4.5) siguiendo los pasos descritos en la sección 2.
4. Día 3:
   1. Diluya estos cultivos a un diámetro exterior de_{600 nm} de 0,01 (medido por espectrofotómetro) hasta un volumen total de al menos 6 ml de BBM⁺ precalentado. Alícuota de 1,5 mL de cada uno de los siete cultivos de población ancestral diluidos en tres tubos perforados separados de 2 mL, uno para cada tratamiento de temperatura establecido en el paso 5.2.
      NOTA: Este paso de alícuota asegura que cualquier variación genética presente en cada población ancestral esté presente en todos los tratamientos de temperatura al comienzo del experimento de evolución. Estos cultivos actuarán como transferencia 0 (Tx0) para comenzar el experimento de evolución de la temperatura.
   2. Selle los tubos con la membrana transpirable y coloque cada conjunto de siete poblaciones ancestrales en termomezcladores separados. Ajuste cada termomezclador a la temperatura requerida y a 400 rpm para comenzar el experimento de evolución.
5. Día 5:
   1. A las 48 h, realizar la transferencia 1 (Tx1) inoculando 1,5 mL de medio BBM⁺ calentado en un tubo perforado de 2 mL con 15 μL de cultivo de cada uno de los cultivos Tx0 (dilución 1:100). Para mayor velocidad, lleve a cabo este paso con una pipeta multicanal de ancho variable para completar múltiples transferencias de un solo experimento al unísono, reduciendo el tiempo que los cultivos están fuera del termomezclador.
   2. Al igual que antes, selle los tubos antes de volver a colocarlos en posiciones aleatorias en sus respectivos termomezcladores. Realice la aleatorización manualmente o a través de los aleatorizadores de pozos iMetaLab 96.
6. Mida el diámetro exterior de_{600 nm} de Tx0 en un espectrofotómetro basado en placas (200 μL en placas de 96 pocillos; se utiliza el mismo volumen de BBM⁺ como blanco) para rastrear el crecimiento de los linajes independientes.
   NOTA: El diámetro exterior_{de 600 nm} debe medirse después de realizar la transferencia a un medio fresco para evitar la contaminación. La densidad óptica también se puede medir por otros medios, como con un espectrofotómetro estándar. El uso de un espectrofotómetro basado en placas permite la medición simultánea de múltiples cultivos, lo que agiliza el proceso.
7. Repita los pasos 5.5 y 5.6 los días 7, 9, 11, etc., correspondientes a Tx2, Tx3, Tx4, etc. Mantenga la temperatura constante para los tratamientos de 75 °C y 65 °C. Para el tratamiento de caída de temperatura, disminuya la temperatura en 1 °C cada segundo de transferencia (es decir, en Tx2, Tx4, Tx6, etc.).
8. Prepare las reservas de glicerol (paso 3.2.3) de las poblaciones después de cada^10ª transferencia (es decir, Tx10, Tx20, etc.), etiquetando el tubo con el identificador de población ancestral (por ejemplo, SA1 para la^1ª población independiente) y el número de transferencia (por ejemplo, Tx10 para la 10ª transferencia). Utilice estas reservas de glicerol más adelante para revivir las poblaciones para estudiar cómo cambiaron las poblaciones con el tiempo o para reiniciar el experimento si es necesario (por ejemplo, debido a la contaminación o incidentes inesperados que resulten en la pérdida de cultivos).
9. Deje que el experimento continúe ya sea para un número predeterminado de transferencias o hasta que haya transcurrido un número predeterminado de generaciones. En la transferencia final, prepare las reservas de glicerol de todos los linajes descendientes.
   NOTA: Aquí, el experimento continuó hasta que el tratamiento de caída de temperatura alcanzó los 65 °C, lo que ocurrió en Tx22. Esto corresponde a aproximadamente 150 generaciones (calculado sobre la base del factor de dilución de 100 en 4,6: log₂(100) = 6,64 generaciones por transferencia). La duración de los experimentos de evolución se puede ajustar de acuerdo con los requisitos experimentales.

6. Ensayos de crecimiento de experimentos posteriores a la evolución: linajes ancestrales vs. evolucionados

NOTA: En la Figura 2 se presenta un diagrama conceptual que describe el protocolo de ensayo de crecimiento/aptitud.

1. Prepare tubos perforados de 2 mL con BBM⁺ de 1,5 mL. Prepara suficientes tubos para cultivar todos los linajes descendientes más cada una de las cepas ancestrales.
2. Revivir las poblaciones ancestrales y cada población descendiente almacenada en el paso 5.9 después de la transferencia final del experimento de evolución utilizando el método descrito en los pasos 2.2-2.5, pero con incubación a la temperatura que cada población experimentó para las dos transferencias finales del experimento de evolución, es decir, 75 °C para el tratamiento constante de 75 °C, y 65 °C para los experimentos de constante de 65 °C y caída de temperatura. Para lograr densidades de población comparables, realice la incubación a 75 °C durante 72 h y la incubación a 65 °C durante 120 h.
3. Mida el diámetro exterior de_{600 nm} de los cultivos cultivados a través de un espectrofotómetro basado en placas.
4. Realizar ensayos de crecimiento de cada población descendiente y de cada cepa ancestral a ambas temperaturas (es decir, 75 °C y 65 °C) en tres repeticiones. Prepare tubos de centrífuga perforados de 2 mL con 1,5 mL de BBM⁺. Prepara seis tubos para cada linaje evolucionado y cada cepa ancestral. Etiquete los tubos con el nombre del linaje (SA1-7 o ancestro), la temperatura de crecimiento (75 °C o 65 °C) y el ID de réplica (1, 2 o 3).
   NOTA: Si se dispone de menos de seis termomezcladores, el ensayo de crecimiento puede replicarse durante varios días en varios bloques experimentales. En este caso, es importante medir cada linaje y ancestro en cada bloque experimental para que los efectos de los bloques puedan estimarse y contabilizarse estadísticamente.
5. Inocular el medio fresco en los seis tubos preparados con 15 μL de cultivo de cada linaje descendiente y cepa ancestral.
6. Ajuste tres termomezcladores a 75 °C y tres termobatidores a 65 °C, designando cada termomezclador a un ID replicado. Coloque los tubos en el termomezclador correspondientes a la temperatura y replique el ID. Dentro de cada termomezclador, asegúrese de que los linajes y ancestros estén colocados aleatoriamente para controlar la heterogeneidad.
7. Selle cada conjunto de 24 tubos con una membrana permeable. Incubar durante 48 h.
8. Transfiera 200 μL de cada cultivo a una placa de 96 pocillos. Mida el diámetro exterior_{de 600 nm} con un espectrofotómetro.
   NOTA: Se puede utilizar una pipeta multicanal de ancho variable para facilitar la transferencia entre los tubos de microcentrífuga y las placas de 96 pocillos.
9. Trazar y analizar datos utilizando software estadístico (por ejemplo, R).

7. Secuenciación del genoma completo de linajes evolucionados e identificación de mutaciones

1. Revivir los linajes descendientes almacenados en el paso 5.9 en BBM⁺ precalentado a 75 °C durante 48-72 h inoculando una pizca de hielo de cada población congelada en BBM⁺ como en la sección 2, pasos 2.2-2.5. Preparar entre 1-10 mL de volumen de cultivo para obtener una cantidad suficiente de ADN genómico. El volumen exacto requerido depende de la opción elegida para la secuenciación en los pasos 7.2 o 7.3 (a continuación).
   NOTA: Es una buena práctica secuenciar también la cepa utilizada para iniciar las poblaciones ancestrales. Esto es para determinar correctamente si las mutaciones detectadas en los linajes descendientes surgieron durante el experimento de evolución y no antes.
2. (Opción 1) Extraiga el ADN genómico y prepare las bibliotecas de secuenciación de Illumina para la secuenciación de Illumina.
   1. Extraiga y purifique el ADN genómico utilizando un kit comercial de extracción de ADN genómico para bacterias.
   2. Asegúrese de que el ADN genómico extraído cumpla con los requisitos de cantidad y calidad del proveedor de secuenciación mediante el uso de kits comerciales recomendados por el proveedor.
   3. Realice la preparación de la biblioteca de ADN genómico utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se recomienda un protocolo de extremo emparejado de 250 pb. Almacene el ADN genómico extraído a -20 °C hasta que esté listo para enviar muestras al proveedor de secuenciación.
3. (Opción 2) Alternativamente, envíe las muestras a un proveedor comercial que realice la extracción de ADN, los controles de calidad del ADN genómico, la preparación de la biblioteca de Illumina y la secuenciación de Illumina como un servicio combinado.
4. Analice genomas secuenciados para identificar mutaciones.
   1. Reciba archivos FASTQ y, si aún no lo ha realizado el proveedor de secuenciación, realice el recorte del adaptador con Trimmomatic con un corte de calidad de ventana deslizante de Q15.
   2. Usando los archivos FASTQ recortados, ejecute la canalización breseq (versión 0.38.1) para detectar mutaciones, comparando las lecturas de ADN genómico con la secuencia de referencia para la cepa elegida. Para S. acidocaldarius DSM639, este es RefSeq ID NC_007181.

8. (Opcional) Evaluación del consumo de energía de la termomezcladora frente a la incubadora

1. Para comparar el consumo de energía del uso de una incubadora frente a un termomezclador para el crecimiento, mida el consumo de energía de cada dispositivo durante 24 horas utilizando un enchufe de monitoreo de energía.
2. Utilice dos enchufes para medir el consumo de energía de ambos dispositivos al mismo tiempo. Alternativamente, mida el consumo de energía en días sucesivos.
3. Desconecte la incubadora o la termobatidora de la toma de corriente. Conecte el enchufe de monitoreo de energía a la toma de corriente e inicialícelo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluida la instalación del software de monitoreo y control.
4. Conecte la incubadora o el termomezclador al enchufe de control de energía y déjelo funcionar durante un mínimo de 2 h (pero idealmente durante 24 h o más) para lograr una buena estimación del consumo de energía típico. Registre el consumo de energía de cada dispositivo.

Resultados

Mediciones de la curva de crecimiento
Las curvas de crecimiento para S. acidocaldarius DSM639 se muestran en la Figura 3A. Se encontró que el crecimiento fue similar al comparar la incubación con termomezcladores con la de las incubadoras convencionales. Los parámetros de la tasa de crecimiento promedio se estimaron ajustando una curva logística a cada curva de crecimiento replicada y calculando la media y el error estándar....

Discusión

Este trabajo ha desarrollado un protocolo experimental de evolución para termófilos, aquí adaptado para la arquea S. acidocaldarius, pero adaptable a otros microbios con requisitos de crecimiento a altas temperaturas. Este protocolo se basa en técnicas inicialmente diseñadas para bacterias mesófilas, pero se modifica específicamente para superar los desafíos técnicos asociados con el crecimiento aeróbico a alta temperatura 2,4,5,24.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.