Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de evolución experimental para la adaptación en termófilos utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética como incubadoras. La técnica se demuestra a través de la caracterización de la adaptación a la temperatura en Sulfolobus acidocaldarius, una arquea con una temperatura óptima de crecimiento de 75 °C.

Resumen

El arqueo Sulfolobus acidocaldarius ha surgido como un prometedor sistema modelo termófilo. Investigar cómo los termófilos se adaptan a los cambios de temperatura es un requisito clave, no solo para comprender los procesos evolutivos fundamentales, sino también para desarrollar S. acidocaldarius como chasis para la bioingeniería. Un obstáculo importante para llevar a cabo la evolución experimental con termófilos es el costo del mantenimiento del equipo y el uso de energía de las incubadoras tradicionales para el crecimiento a alta temperatura. Para abordar este desafío, se presenta un protocolo experimental integral para llevar a cabo la evolución experimental en S. acidocaldarius, utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética. El protocolo implica una técnica de cultivo por lotes con volúmenes relativamente pequeños (1,5 mL), lo que permite el seguimiento de la adaptación en múltiples linajes independientes. Este método es fácilmente escalable mediante el uso de termomezcladores adicionales. Este enfoque aumenta la accesibilidad de S. acidocaldarius como sistema modelo al reducir tanto la inversión inicial como los costos continuos asociados con las investigaciones experimentales. Además, la técnica es transferible a otros sistemas microbianos para explorar la adaptación a diversas condiciones ambientales.

Introducción

La vida primitiva en la Tierra puede haberse originado en ambientes extremos, como los respiraderos hidrotermales, que se caracterizan por temperaturas y acidez extremadamente^altas. Los microbios continúan habitando en ambientes extremos, incluyendo aguas termales y solfatara volcánica. La caracterización de la dinámica evolutiva que ocurre en estas condiciones extremas puede arrojar luz sobre los procesos fisiológicos especializados que permiten la supervivencia en estas condiciones. Esto puede tener implicaciones de gran alcance, desde nuestra comprensión de los orígenes de la diversidad biológica hasta el de....

Protocolo

1. Preparación del medio de crecimiento de S. acidocaldarius (BBM⁺)

NOTA: Para cultivar S. acidocaldarius, este protocolo utiliza Basal Brock Medium (BBM⁺)²³. Esto se prepara combinando primero las soluciones madre inorgánicas que se describen a continuación para crear BBM^-, que se puede preparar con anticipación. A continuación, BBM⁺ se prepara según sea necesario añadiendo las soluciones madre orgánicas a BBM⁻. Las recetas de soluciones madre también se presentan en la Tabla 1.....

Resultados

Mediciones de la curva de crecimiento
Las curvas de crecimiento para S. acidocaldarius DSM639 se muestran en la Figura 3A. Se encontró que el crecimiento fue similar al comparar la incubación con termomezcladores con la de las incubadoras convencionales. Los parámetros de la tasa de crecimiento promedio se estimaron ajustando una curva logística a cada curva de crecimiento replicada y calculando la media y el error estándar........

Discusión

Este trabajo ha desarrollado un protocolo experimental de evolución para termófilos, aquí adaptado para la arquea S. acidocaldarius, pero adaptable a otros microbios con requisitos de crecimiento a altas temperaturas. Este protocolo se basa en técnicas inicialmente diseñadas para bacterias mesófilas, pero se modifica específicamente para superar los desafíos técnicos asociados con el crecimiento aeróbico a alta temperatura 2,4,5,24.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.