הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.

Abstract

הארכיאון Sulfolobus acidocaldarius התגלה כמערכת מודל תרמופילית מבטיחה. חקירת האופן שבו תרמופילים מסתגלים לטמפרטורות משתנות היא דרישת מפתח, לא רק להבנת תהליכים אבולוציוניים בסיסיים אלא גם לפיתוח S. acidocaldarius כמארז לביו-הנדסה. מכשול עיקרי אחד לביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים הוא הוצאות תחזוקת ציוד ושימוש באנרגיה של אינקובטורים מסורתיים לגידול בטמפרטורה גבוהה. כדי להתמודד עם אתגר זה, מוצג פרוטוקול ניסויי מקיף לביצוע אבולוציה ניסיונית ב- S. acidocaldarius , תוך שימוש בתרמומיקסרים בעלי עלות נמוכה וחסכוניים באנרגיה. הפרוטוקול כולל טכניקת תרבית אצווה עם נפחים קטנים יחסית (1.5 מ"ל), המאפשרת מעקב אחר הסתגלות במספר שושלות עצמאיות. שיטה זו ניתנת להרחבה בקלות באמצעות שימוש בתרמומיקסרים נוספים. גישה כזו מגדילה את הנגישות של S. acidocaldarius כמערכת מודל על ידי הפחתת ההשקעה הראשונית והעלויות המתמשכות הקשורות לחקירות ניסיוניות. יתר על כן, הטכניקה ניתנת להעברה למערכות מיקרוביאליות אחרות לחקר הסתגלות לתנאי סביבה מגוונים.

Introduction

ייתכן שהחיים המוקדמים על פני כדור הארץ מקורם בסביבות קיצוניות, כגון נביעות הידרותרמיות, המאופיינות בטמפרטורות וחומציות גבוהות במיוחד¹. מיקרובים ממשיכים לאכלס סביבות קיצוניות, כולל מעיינות חמים וסולפטארה וולקנית. אפיון הדינמיקה האבולוציונית המתרחשת בתנאים קיצוניים אלה עשוי לשפוך אור על התהליכים הפיזיולוגיים המיוחדים המאפשרים הישרדות בתנאים אלה. עשויות להיות לכך השלכות נרחבות, החל מהבנתנו את מקורות המגוון הביולוגי ועד לפיתוח אנזימים חדשים בטמפרטורה גבוהה עם יישומים ביוטכנולוגיים.

ההבנה של דינמיקה אבולוציונית מיקרוביאלית בסביבות קיצוניות נותרה מוגבלת למרות חשיבותה הקריטית. לעומת זאת, גוף ידע משמעותי על אבולוציה בסביבות מזופיליות נרכש באמצעות יישום טכניקה המכונה אבולוציה ניסיונית. אבולוציה ניסויית כוללת התבוננות בשינויים אבולוציוניים בתנאי מעבדה 2,3,4,5. לעתים קרובות, מדובר בסביבת שינוי מוגדרת (למשל, טמפרטורה, מליחות, הכנסת רעלן או אורגניזם מתחרה)^7,8,9. בשילוב עם ריצוף גנום שלם, האבולוציה הניסויית אפשרה לנו לבחון היבטים מרכזיים של תהליכים אבולוציוניים, כולל תקבולת, חזרתיות והבסיס הגנומי להסתגלות. עם זאת, עד כה, רוב האבולוציה הניסויית בוצעה עם מיקרובים מזופיליים (כולל חיידקים, פטריות ווירוסים 2,3,4,5, אך במידה רבה לא כולל ארכאה). שיטה לאבולוציה ניסיונית הישימה למיקרובים תרמופיליים תאפשר לנו להבין טוב יותר כיצד הם מתפתחים ותתרום להבנה מקיפה יותר של האבולוציה. יש לכך השלכות פוטנציאליות נרחבות, החל מפענוח מקורות החיים התרמופיליים על פני כדור הארץ וכלה ביישומים ביוטכנולוגיים הכוללים "אקסטרמוזימים" המשמשים בתהליכים ביולוגיים בטמפרטורה גבוהה¹⁰ ובמחקר אסטרוביולוגי¹¹.

הארכאון Sulfolobus acidocaldarius הוא מועמד אידיאלי כאורגניזם מודל לפיתוח טכניקות אבולוציה ניסיוניות עבור תרמופילים. S. acidocaldarius מתרבה באופן אירובי, עם טמפרטורת גידול אופטימלית ב 75 ° C (טווח 55 ° C עד 85 ° C) וחומציות גבוהה (pH 2-3) 4,6,12,13,14. למרבה הפלא, למרות תנאי הגידול הקיצוניים שלו, S. acidocaldarius שומר על צפיפות אוכלוסייה ושיעורי מוטציות דומים למזופילים 7,15,16,17,18. בנוסף, הוא בעל גנום קטן יחסית, מבואר היטב (זן DSM639: 2.2 Mb, 36.7% GC, 2,347 גנים)¹²; S. acidocaldarius נהנה גם מכלים חזקים להנדסת גנום, המאפשרים הערכה ישירה של התהליך האבולוציוני באמצעות נוקאאוטים גנטיים ממוקדים¹⁹. דוגמה בולטת לכך היא זמינותם של זנים מהונדסים גנטית של S. acidocaldarius, כגון זנים auxotrophic uracil של MW001¹⁹ ו- SK-1²⁰, אשר יכולים לשמש סמנים לבחירה.

ישנם אתגרים משמעותיים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. דגירה ממושכת בטמפרטורות גבוהות הנדרשות למחקרים אלה כופה אידוי ניכר הן בטכניקות גידול נוזליות והן בטכניקות גידול מוצקות. פעולה ממושכת בטמפרטורות גבוהות עלולה לפגוע גם באינקובטורים המסורתיים המשמשים בדרך כלל באבולוציה ניסיונית במדיה נוזלית. חקר טמפרטורות מרובות מחייב השקעה כספית משמעותית לרכישה ותחזוקה של מספר חממות. יתר על כן, צריכת האנרגיה הגבוהה הנדרשת מעוררת חששות סביבתיים ופיננסיים משמעותיים.

עבודה זו מציגה שיטה להתמודד עם האתגרים הנתקלים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. בהתבסס על טכניקה שפותחה על ידי Baes et al. לחקר תגובת הלם חום^14,21, השיטה שפותחה כאן משתמשת בתרמומיקסרים על ספסל לדגרה עקבית ואמינה בטמפרטורה גבוהה. המדרגיות שלה מאפשרת הערכה בו זמנית של טיפולי טמפרטורה מרובים, עם עלויות מופחתות ברכישת ציוד דגירה נוסף. זה משפר את יעילות הניסוי, ומאפשר ניתוח סטטיסטי חזק וחקירה מקיפה של גורמים המשפיעים על דינמיקה אבולוציונית בתרמופילים²². יתר על כן, גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את ההשקעה הראשונית הפיננסית ואת צריכת האנרגיה בהשוואה לחממות מסורתיות, ומציעה חלופה בת קיימא וידידותית יותר לסביבה.

השיטה שלנו מניחה את היסודות לחקירה ניסויית של דינמיקה אבולוציונית בסביבות המאופיינות בטמפרטורות קיצוניות, שייתכן שמילאו תפקיד מפתח בשלבים המוקדמים של גיוון החיים על פני כדור הארץ. לאורגניזמים תרמופיליים יש תכונות ייחודיות, אך תנאי הגידול הקיצוניים שלהם והדרישות המיוחדות שלהם הגבילו לעתים קרובות את נגישותם כמערכת מודל. התגברות על מחסומים אלה לא רק מרחיבה את הזדמנויות המחקר לחקר דינמיקה אבולוציונית, אלא גם משפרת את התועלת הרחבה יותר של תרמופילים כמערכות מודל במחקר מדעי.

Protocol

1. הכנת מדיום גידול S. acidocaldarius (BBM ⁺)

הערה: כדי לטפח S. acidocaldarius, פרוטוקול זה משתמש במדיום ברוק בסיסי (BBM⁺)²³. זה מוכן על ידי שילוב ראשוני של פתרונות מלאי אנאורגניים המפורטים להלן כדי ליצור BBM ⁻, אשר עשוי להיות מוכן מראש. לאחר מכן BBM⁺ מוכן לפי הצורך על ידי הוספת פתרונות מלאי אורגניים ל- BBM⁻. מתכוני תמיסות מלאי מוצגים גם בטבלה 1. כל פתרונות המדיה והמלאי צריכים להיות מוכנים בזיקוק כפול H₂O (ddH₂O).

1. הכנת פתרונות מלאי אנאורגניים למדיום צמיחה
   1. הכן פתרון מלאי של Trace Element.
      1. הכן תמיסת מלאי יסודות קורט על ידי הוספת 9 גרם / ליטר של נתרן טטרבוראט decahydrate (Na₂B₄O₇·10H₂O) ל- ddH₂O, ואחריו תוספת של 1: 1 H₂SO₄ טיפה עד שהוא מתמוסס.
      2. הצג ברצף 0.44 גרם/ליטר אבץ גופרתי הפטהידראט (ZnSO₄·7H₂O), 0.1 גרם/ליטר נחושת(II) כלוריד דיהידרט (CuCl₂·2H₂O), 0.06 גרם/ליטר נתרן מוליבדט דיהידרט (Na₂MoO₄·2H₂O), 0.06 גרם/ליטר של ונדיום(IV) סולפט דיהידרט (VOSO_{4.2H 2}O), 0.02 גרם/ליטר קובלט(II) סולפט הפטהידראט (CoSO₄·7H₂O), ו-3.6 גרם/ליטר של טטרהידרט כלוריד מנגן(II) (MnCl₂·4H₂O). Autoclave את הפתרון ולאחסן ב 4 ° C.
   2. הכינו את תמיסת מלאי Fe (1000x) על ידי המסת 20 גרם/ליטר ברזל כלוריד הקסהידראט (FeCl₃·6H₂O) ב-ddH₂O. עקרו את התמיסה על ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
   3. הכינו את תמיסת ברוק I (1000x) על ידי המסת סידן כלורי 70 גרם/ליטר (CaCl₂·2H₂O) במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O). Autoclave ולאחסן ב 4 °C.
      זהירות: המסת CaCl₂·2H₂O במים היא תהליך אקסותרמי. בצע שלב זה בזהירות. יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה. אין לסגור היטב את כלי השיט, מכיוון שהלחץ עלול להצטבר.
   4. הכן את תמיסת ברוק II/III על ידי שילוב של 130 גרם/ליטר של אמוניום סולפט ((NH₄)₂SO₄), 25 גרם/ליטר של מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO₄·7H₂O), 28 גרם/ליטר אשלגן דימימן פוספט (KH₂PO₄), ו-50 מ"ל של תמיסת מלאי יסודות קורט שהוכנה בעבר. באמצעות 1:1 H₂SO₄, התאם את ה- pH של פתרון המניות ל- 2-3. בצע Autoclave של הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכנת פתרונות מלאי אורגני למדיום צמיחה
   1. הכינו את D-Glucose Stock Solution (פי 100) על ידי המסת 300 גרם/ליטר (30% w/v) של D-גלוקוז ב-ddH₂O ובצעו חיטוי (דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: ניתן להשתמש במקורות פחמן אחרים במקום D-גלוקוז בהתאם לדרישות הניסוי (למשל, D-xylose).
   2. הכינו פפטון מתמיסת מלאי קזאין (100x) על ידי המסת פפטון מקזאין ב-100 גרם/ליטר ב-ddH₂O. Autoclave כדי לעקר ולאחסן את תמיסת המלאי ב-RT.
   3. הכנת Uracil Stock Solution (100x) על ידי המסת 2 גרם / ליטר של אורציל ב- ddH₂O וסינון סטריליזציה (דרך מסנן 0.22 מיקרומטר); יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
3. הכנת מדיום גידול BBM⁺ בריכוז עבודה 1x
   1. ראשית, להכין 988 מ"ל של ddH_{סטרילי 2}O על ידי autoclaving.
   2. הכן 1 ליטר BBM⁻ על ידי הוספת 1 מ"ל של Brock Stock Solution I, 10 מ"ל של Brock Stock Solution II/III ו-1 מ"ל של תמיסת מלאי Fe ל-988 מ"ל של ddH₂O סטרילי שהופעל בעבר. התאם את ה- pH הבינוני לטווח של 2-3 עם 1:1 H₂SO₄.
      הערה: BBM⁻ ניתן להכין מראש ולאחסן ב- RT עד חודש אחד.
   3. לבסוף, כדי לייצר 1 ליטר BBM⁺, שלבו 10 מ"ל כל אחד של D-Glucose Stock Solution, Peptone מ-Casein Stock Solution ו-Uracil Stock Solution עם 985 מ"ל BBM⁻. מערבבים היטב ומתאימים את רמת החומציות הבינונית ל-2-3 עם 1:1 H₂SO₄.
      הערה: BBM⁺ צריך להיות מיוצר טרי לפי הצורך.
4. הכנת מדיום מוצק ^BBM+
   1. להכין 1 M פתרונות מלאי של MgCl₂ ו CaCl₂; אלה יסייעו בהתמצקות התווך המוצק BBM. עבור 1 M MgCl₂, להוסיף 9.5 גרם ל 100 מ"ל של ddH₂O. עבור 1 M CaCl₂, להוסיף 11 גרם עד 100 מ"ל של ddH₂O. Autoclave כדי לעקר.
      זהירות: המסת CaCl₂·2H₂O במים היא תהליך אקסותרמי. בצע שלב זה בזהירות. יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה. אין לסגור היטב את כלי השיט, מכיוון שהלחץ עלול להצטבר.
   2. יש לערבב 3% (w/v) גאם gellan (למשל, 30 גרם/ליטר) ב-ddH₂O ו-autoclave לעיקור.
      הערה: מסטיק Gellan (למשל, Gelrite) משמש כאן כסוכן gelling, כמו אגר בקטריולוגי סטנדרטי לא יכול להתמצק ב 75 ° C.
   3. בנפרד, הכינו את BBM⁺ למדיום מוצק, אותו יש לערבב ביחס של 1:1 עם מסטיק הגלן הסטרילי שהוכן בשלב 1.4.1.
      1. ראשית, הכינו 1 ליטר BBM⁻ כמו בשלב 1.3.2. שלב 887 מ"ל של BBM⁻ עם 1 מ"ל של תמיסת Fe Stock Solution ו-20 מ"ל כל אחד של D-Glucose Stock Solution, Peptone מ-Casein Stock Solution ו-Uracil Stock Solution.
      2. הוסף 40 מ"ל של 1 M MgCl₂ ו- 12 מ"ל של 1 M CaCl₂. מערבבים היטב ומתאימים את רמת החומציות הבינונית ל-2-3 עם 1:1 H₂SO₄.
         הערה: נפחי פתרונות המלאי שנוספו כאן גדולים במכוון מאשר להכנת BBM⁺ נוזלי בשלב 1.3. זה כדי להסביר ערבוב ביחס של 1:1 עם מסטיק gellan מותך בשלב הבא.
   4. מחממים את BBM⁺ לקבלת מדיום מוצק עד כ-75°C ומערבבים ביחס של 1:1 עם מסטיק gellan מותך ב-ddH₂O. מערבבים היטב ומוזגים לפלסטיק יציב בחום (למשל, פוליפרופילן), צלחות פטרי מזכוכית או צלחות בעלות שש בארות לצמיחה שלS. acidocaldarius. השתמשו באגר מיד לאחר הערבוב, מכיוון שהוא יתחיל במהירות.
      הערה: חלק מצלחות הפטרי בקוטר 90 מ"מ מפוליסטירן המשמשות בדרך כלל למיקרוביולוגיה יתעוותו אם ידגרו עליהן בטמפרטורות גבוהות לפרקי זמן ממושכים.
      זהירות: יש לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בעת התמודדות עם נוזלים חמים; יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 להגנה מפני פציעה.

2. החייאת S. acidocaldarius מתרבית מלאי מקפיא

1. הכנת צינורות גדילה מאווררים להבטחת אוורור וזמינות חמצן מספקת.
   1. מראש, להכין פירסינג 2 מ"ל צינורות microcentrifuge לצמיחה Sulfolobus . מחממים בזהירות חוט קהה (>0.7 מ"מ, כגון אטב נייר מיושר) באמצעות להבת מבער Bunsen ומנקבים את מכסה הצינור, תוך יצירת חור קטן של כ-1 מ"מ.
   2. הניחו צינורות מנוקבים בכלי שיט אוטוקלאבנטי (למשל, קופסת קצה פיפטה ריקה) ואוטוקלאבה לעיקור.
      אזהרה: יש ללבוש כפפות סיכון תרמי בדירוג EN407 כדי להגן מפני פגיעה תרמית בידיים כתוצאה ממתכת מחוממת. חממו את החוט לזמן קצר בלבד (1-2 שניות) כדי למנוע התחממות יתר. יש להשתמש רק במתכות בעלות טמפרטורת התכה גבוהה (פלדה).
2. לחסן תרביות Starter של S. acidocaldarius.
   1. מלאו את צינורות ה-2 מ"ל המחוררים ב-1.5 מ"ל של BBM⁺ שחומם מראש (כפי שהוכן בסעיף 1, מודגר מראש ב-75°C למשך 15 דקות לפחות).
   2. יש לחסן את הצינורות המלאים ב-BBM⁺ באמצעות גירוד (שווה ערך ל-50-60 מ"ג) ממלאי גליצרול (25% v/v גליצרול, מאוחסן ב-80°C-). כאן, S. acidocaldarius זן DSM639 משמש. מלא צינור נוסף עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
3. כדי למנוע מאירוסולים כלשהם לברוח ממכסה הצינור המנוקב בנפח 2 מ"ל ולזהם את סביבת הגידול (וכל דגימה אחרת) וכדי להפחית את השונות של אידוי התרבית בתוך הצינורות, הניחו על גבי המכסה קרום חדיר לגז שיכול לעמוד בטמפרטורות גבוהות (65-85 מעלות צלזיוס) ולחסום בריחה/חדירה מיקרוביאלית.
   הערה: השימוש בקרומים חדירים לגז לאיטום צינורות מפחית באופן משמעותי את האידוי. במהלך תקופה של 48 שעות ב 75 ° C, צינורות אטומים להציג אובדן נפח ממוצע של 8.63% (טווח: 3.29-16.45%, n = 24 עותקים טכניים, חזר פעמיים), לעומת 25.05% (טווח: 11.92-62.91%, n = 24 עותקים טכניים, חזר פעמיים) עבור צינורות לא אטומים.
4. יש לדגור על הצינורות המחוסנים בתרמומיסר בטמפרטורה של 75°C עם טלטול מתמיד ב-400 סיבובים לדקה (סל"ד) למשך 48-72 שעות או עד ש-OD_600nm של 0.3-0.8 יגיע כפי שנמדד על ידי ספקטרופוטומטר.
   הערה: המכסה המנוקב של צינורות 2 מ"ל ורעד מאפשרים אוורור מתאים לצמיחה אופטימלית. מכסה התרמיקסר צריך להיות במקום כדי להבטיח שמירה על טמפרטורה עקבית ולהפחית אידוי.
5. לאחר תקופת הדגירה, תנו לתרבויות המחודשות שלב צמיחה שני (התניה מוקדמת).
   1. גלולה למטה את התרביות על ידי סיבוב צינורות ב 5000 x גרם במשך 2 דקות ב RT. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-BBM⁺ חם טרי של 1.5 מ"ל.
      הערה: ניסוי זה משתמש בזן הבר DSM639 מסוג S. acidocaldarius , אך שיטות גידול ואבולוציה ניסיונית אלה יכולות להיות מיושמות על כל זן Sulfolobus ואולי תרמופילים אחרים.

3. קביעת צפיפות אוכלוסין, זמן הכפלה ושלב גידול מעריכי עבור S. acidocaldarius

1. קבע צפיפות אוכלוסייה וזמן לשלב גידול מעריכי עבור תנאי הבחירה שנבחרו. עבור כל מצב סביבתי שייבדק, הכינו שלוש תרביות התחלה בעקבות שלבים 2.1-2.5.
2. דללו את שלוש התרביות ב-BBM⁺ ל-OD_600nm של 0.01. לעשות לפחות 20 מ"ל מכל תרבית. שלוש תרבויות אלה מייצגות העתקים טכניים.
3. בצע עקומות גדילה משוכפלות של OD_600nm לאורך זמן באמצעות דגימה הרסנית.
   1. הכינו 24 צינורות 2 מ"ל מנוקבים משלב 2.1, הפרידו אותם לשלושה סטים של שמונה, ותייגו את השכפולים הטכניים האלה 1, 2 ו-3 (למשל, שמונה צינורות המסומנים כמשוכפלים 1 וכו').
   2. מכל אחת משלוש התרביות המדוללות משלב 3.2, פיפטה 1.5 מ"ל לשבעה צינורות מוכנים. מלא את הצינור הנותר עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
4. יש לדגור על כל 24 הצינורות בתרמומיקסר בטמפרטורה של 75°C ו-400 סל"ד. חותמים עם קרום חדיר לגז. במרווחי זמן קבועים (כגון 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 שעות), הסר צינור אחד מכל אחד משלושת העותקים המשוכפלים ומדוד OD_600nm באמצעות ספקטרופוטומטר, ולאחר מכן השליך את הצינור. החלף את הממברנה החדירה לגז לאחר הסרת צינור.
5. במקביל, לקבוע את הקשר בין OD_600nm לבין צפיפות האוכלוסייה. בצע דילולים טוריים (1 x ^10-1 עד 1 x ^10-6) בתווך BBM⁺ למשך שלוש נקודות זמן לפחות (באופן אידיאלי, התחלה, אמצע וסוף). יש לחסן 100 מיקרוליטר מכל דילול על מדיום BBM⁺ מוצק (מוכן כמו בשלב 1.4).
   הערה: כדי להשיג צמיחה עקבית של המושבה וספירה מדויקת, עדיף להעביר את התרבית המדוללת למדיה מוצקה במקום מבלי לבצע פיזור מכני, כגון שימוש בפיזור בצורת L או חרוזי זכוכית. נראה כי התפשטות מכנית משפיעה לרעה על היווצרות מושבות.
6. לדגור את הלוחות באינקובטור סטטי ב 75 מעלות צלזיוס עד הופעת מושבות (5-7 ימים).
   1. במהלך פרק זמן זה, שמרו על לחות האינקובטור כדי למנוע התייבשות מוגזמת של הלוחות, אחרת לא ייווצרו מושבות.
   2. השיגו זאת על ידי הנחת הצלחות בקופסת פוליפרופילן סגורה המרופדת במטלית לחה. נקבו את מכסה הקופסה לפחות שלוש פעמים כדי לאפשר אוורור.
   3. מניחים דליי מים באינקובטור כדי להגביר את הלחות. מלאו את הדליים מדי יום.
7. לאחר שכל מדידות OD_600nm נאספו, קבע את זמן וזמן ההכפלה כדי להגיע לשלב הצמיחה המעריכית על ידי התאמת עקומה לוגיסטית לקשר בין OD_600nm לזמן, לדוגמה, באמצעות SummarizeGrowth מחבילת Growthcurver ב- R.
8. לאחר שנוצרו מושבות גלויות על מדיה מוצקה, ספרו יחידות יוצרות מושבות (CFUs), במטרה לספור מגורם הדילול, ולייצר 50-100 מושבות לדיוק הטוב ביותר.
9. חשב את צפיפות התא בתווך התרבית באמצעות הנוסחה: CFU/mL = מספר מושבות/(גורם דילול × מצופה נפח).
10. בצע רגרסיה ליניארית של יומן רישום כדי לקבוע את הקשר בין log10(CFU) ו- log10(OD_600nm). לפיכך, חשב את ה- CFU/mL החזוי עבור OD נתון מהשיפוע והיירוט של מודל הרגרסיה: CFU חזוי = 10^{[שיפוע × log10(OD600nm) + יירוט]}.
11. (אופציונלי) כמו כן, בצע שלבים 3.1-3.10 באינקובטור רעד כדי לקבוע אם צמיחה דומה מושגת בתרמומיקסרים.

4. ייזום שושלות עצמאיות לאבולוציה ניסויית

1. יום 1: כדי ליצור מושבות בודדות, תחילה בצע את כל השלבים של סעיף 2 לעיל כדי ליצור תרבות התחלתית.
2. יום 3: מדוד OD_600nm של התרבית כדי לוודא שהיא הגיעה לצפיפות מספקת בשלב המעריכי (OD_600nm 0.3-0.8 על ידי ספקטרופוטומטר).
3. צור דילולים סדרתיים של תרבית S. acidocaldarius DSM639 מ- 1 x ^10-1-1 x ^10-6 ופזר 100 μL מכל דילול 1 x ^10-5 ו- 1 x ^10-6 לבארות של צלחת בת 6 בארות המכילה מדיום BBM⁺ מוצק (סעיף 1 וטבלה 1) במספר העתקים. לדגור על לוחות ב 75 ° C באינקובטור סטטי כמו בשלב 3.5 במשך 5-7 ימים עבור מושבות בודדות להופיע.
4. ימים 8-10 (5-7 ימים לאחר הדגירה):
   1. קבע את מספר השושלות המתפתחות ממושבות בודדות. עבור כל שושלת, בחר מושבה אחת באופן אקראי מתוך הצלחות באמצעות לולאת חיסון. השהה מחדש את המושבה בצינור מנוקב של 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל של מדיום BBM⁺ שחומם מראש. תייגו כראוי את הצינור.
   2. חזור על המספר הרצוי של שושלות; כאן הוקמו שבע שושלות שסומנו כ-SA1-7. מלא צינור נוסף עם 1.5 מ"ל של BBM+ כבקרה שלילית.
   3. אוטמים את החלק העליון של הצינורות עם קרום נושם ודגרים בתרמומיקסר ב 75 ° C, 400 סל"ד במשך 48-72 שעות, עד התרביות להיות עכור (שווה ערך OD_600nm 0.3-0.8 על ידי ספקטרופוטומטר).
5. ימים 10-12 (7-9 ימים לאחר החיסון):
   1. בצנטריפוגה על ספסל, סובבו את תרביות השבט במהירות של 5,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 200 מיקרוליטר של BBM⁺ נוזלי.
   2. ערבבו את מתלי התאים של 200 μL עם 200 μL של 50% גליצרול (25% v/v גליצרול) כדי ליצור מלאי גליצרול של שבע השושלות העצמאיות ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. אלה הן אוכלוסיות האבות של ניסויי האבולוציה.

5. ביצוע ניסוי אבולוציית הטמפרטורה

הערה: תרשים מושגי המתאר את ההיבטים העיקריים של פרוטוקול הניסוי מוצג באיור 1.

1. השתמש בשבע האוכלוסיות הקדמוניות שנוצרו בסעיף 4 לניסוי האבולוציה.
   1. בצע את כל בדיקות האבולוציה הניסיונית בצינורות סטריליים מנוקבים של 2 מ"ל אטומים בקרום חדיר (המתואר לעיל, סעיף 2).
   2. לצד אוכלוסיות אלה, יש לשמור על צינורות 2 מ"ל מנוקבים נפרדים עם 1.5 מ"ל של BBM⁺ כבקרות שליליות ללא תרבית כדי לפקח על זיהום (צולב) ולקבוע סף OD המציין שאין גידול בתרבית.
2. קביעת טיפולי טמפרטורה: שימוש בתרמומיקסרים מאפשר לקבוע טיפולי טמפרטורה מרובים. כאן, השתמש בטיפולי הטמפרטורה הבאים: קבוע 75 ° C, קבוע 65 ° C, וירידה הדרגתית מ 75- 65 ° C על ידי הפחתת הטמפרטורה על ידי 1 ° C כל 4 ימים ("טיפול ירידת טמפרטורה").
   הערה: טיפולים אלה יכולים להיות מותאמים לדרישות ניסוי ספציפיות. יש צורך בתרמומיקסר נפרד לכל טיפול בטמפרטורה.
3. יום 1: החיו את אוכלוסיות האבות הקדמונים ממלאי הגליצרול שלהם (שהוכן בשלב 4.5) בהתאם לצעדים המתוארים בסעיף 2.
4. יום 3:
   1. דללו תרביות אלה ל-OD_600nm של 0.01 (נמדד על ידי ספקטרופוטומטר) לנפח כולל של לפחות 6 מ"ל של BBM⁺ שחומם מראש. Aliquot 1.5 מ"ל מכל אחת משבע תרבויות האוכלוסייה הקדומה המדוללת לשלוש צינורות נפרדים מנוקבים של 2 מ"ל, אחד לכל טיפול טמפרטורה שנקבע בשלב 5.2.
      הערה: שלב זה מבטיח שכל שונות גנטית הקיימת בכל אוכלוסיית אבות תהיה נוכחת בכל טיפולי הטמפרטורה בתחילת ניסוי האבולוציה. תרבויות אלה יפעלו כהעברה 0 (Tx0) כדי להתחיל את ניסוי אבולוציית הטמפרטורה.
   2. אטמו את הצינורות עם הממברנה הנושמת והכניסו כל קבוצה של שבע אוכלוסיות קדמוניות לתרמומיקסרים נפרדים. כוונו כל תרמומיקסר לטמפרטורה הנדרשת ול-400 סל"ד כדי להתחיל את ניסוי האבולוציה.
5. יום 5:
   1. לאחר 48 שעות, בצע העברה 1 (Tx1) על ידי חיסון 1.5 מ"ל מחומם BBM⁺ בינוני בצינור מנוקב 2 מ"ל עם 15 μL של תרבית מכל אחת מתרבויות Tx0 (דילול 1:100). עבור מהירות, בצע שלב זה עם פיפטה רב ערוצית ברוחב משתנה כדי להשלים העברות מרובות מניסוי יחיד ביחד, ובכך להפחית את הזמן שהתרביות נמצאות מחוץ לתרמיקוסר.
   2. כמו קודם, אטמו את הצינורות לפני החזרתם למיקומים אקראיים לתרמומיקסרים המתאימים. בצע אקראיות באופן ידני או באמצעות iMetaLab 96 randomizers היטב.
6. מדוד את OD_600nm של Tx0 בספקטרופוטומטר מבוסס לוחות (200 μL ב-96 לוחות באר; נפח זהה של BBM⁺ משמש ריק) כדי לעקוב אחר צמיחת השושלות הבלתי תלויות.
   הערה: יש למדוד את OD_600nm לאחר ביצוע ההעברה למדיום טרי כדי למנוע זיהום. צפיפות אופטית יכולה להימדד גם באמצעים אחרים, כגון באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי. השימוש בספקטרופוטומטר מבוסס לוחות מאפשר מדידה סימולטנית של תרביות מרובות ומייעל את התהליך.
7. חזור על שלבים 5.5 ו- 5.6 בימים 7, 9, 11 וכו', המתאימים ל- Tx2, Tx3, Tx4 וכו'. החזק את הטמפרטורה קבועה עבור טיפולים 75 ° C ו 65 ° C. לטיפול בנפילת טמפרטורה, הפחיתו את הטמפרטורה ב-1°C בכל העברה שנייה (כלומר, ב-Tx2, Tx4, Tx6 וכו').
8. הכינו מלאי גליצרול (שלב 3.2.3) של אוכלוסיות לאחר כל העברה¹⁰ (כלומר, Tx10, Tx20 וכו'), תיוג הצינור עם מזהה האוכלוסייה הקדומה (למשל, SA1 עבור האוכלוסייה העצמאית^{הראשונה} ) ומספר ההעברה (למשל, Tx10 עבור ההעברה^{העשירית} ). השתמש במאגרי גליצרול אלה מאוחר יותר כדי להחיות אוכלוסיות כדי לחקור כיצד אוכלוסיות השתנו לאורך זמן או כדי להפעיל מחדש את הניסוי במידת הצורך (למשל, עקב זיהום או תקריות בלתי צפויות הגורמות לאובדן תרביות).
9. תנו לניסוי להמשיך או למספר קבוע מראש של העברות או עד שיחלוף מספר דורות קבוע מראש. בהעברה הסופית, הכינו מלאי גליצרול של כל השושלות הצאצאיות.
   הערה: כאן, הניסוי המשיך עד שהטיפול בצניחת הטמפרטורה הגיע ל -65 מעלות צלזיוס, שהתרחש ב- Tx22. זה מתאים לכ -150 דורות (מחושב על בסיס גורם דילול של 100 ב 4.6: יומן₂(100) = 6.64 דורות להעברה). ניתן להתאים את אורך ניסויי האבולוציה בהתאם לדרישות הניסוי.

6. ניסוי שלאחר האבולוציה מבחני צמיחה: שושלות אבות לעומת שושלות מפותחות

הערה: תרשים מושגי המתאר את פרוטוקול בדיקת הצמיחה/הכושר ניתן באיור 2.

1. הכינו צינורות 2 מ"ל מנוקבים עם 1.5 מ"ל BBM⁺. הכינו מספיק צינורות כדי לגדל את כל השושלות הצאצאיות בתוספת כל אחד מזני האבות.
2. להחיות אוכלוסיות אבות, וכל אוכלוסיית צאצאים שאוחסנה בשלב 5.9 לאחר ההעברה הסופית של ניסוי האבולוציה בשיטה המתוארת בשלבים 2.2-2.5, אך עם דגירה בטמפרטורה שכל אוכלוסייה חוותה עבור שתי ההעברות האחרונות של ניסוי האבולוציה, כלומר, 75 ° C עבור הטיפול הקבוע של 75 ° C, ו 65 ° C עבור 65 ° C קבוע וניסויי ירידת טמפרטורה. כדי להשיג צפיפות אוכלוסייה דומה, בצע את הדגירה של 75 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות ואת הדגירה של 65 מעלות צלזיוס במשך 120 שעות.
3. מדוד OD_600nm של התרביות הגדלות באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס לוחות.
4. בצע בדיקות גדילה של כל אוכלוסיית צאצאים וכל זן קדמון בשתי הטמפרטורות (כלומר, 75 ° C ו 65 ° C) בשלושה עותקים משוכפלים. הכינו צינורות צנטריפוגות 2 מ"ל מנוקבים עם 1.5 מ"ל של BBM⁺. הכינו שישה צינורות לכל שושלת מפותחת ולכל זן אבות. תייגו את הצינורות בשם השושלת (SA1-7 או האב הקדמון), טמפרטורת הגידול (75°C או 65°C) והמזהה המשוכפל (1, 2 או 3).
   הערה: אם פחות משישה תרמומיקסרים זמינים, ניתן לשכפל את בדיקת הגידול במשך מספר ימים על פני מספר בלוקים ניסיוניים. במקרה זה, חשוב למדוד כל שושלת ואב קדמון בכל בלוק ניסיוני, כך שניתן יהיה להעריך את השפעות הבלוק ולהסביר אותן סטטיסטית.
5. חסנו את המדיום הטרי בששת הצינורות המוכנים עם 15 μL של תרבית מכל שושלת צאצאים וזן אבות.
6. הגדר שלושה תרמומיקסרים ל- 75 ° C ושלושה תרמומיקסרים ל- 65 ° C, ייעד כל תרמומיקסר למזהה משוכפל. מקם את הצינורות ב- thermomixer המתאים לטמפרטורה ומשכפל ID. בתוך כל תרמומיקסר, ודא כי השושלות והאבות הקדמונים ממוקמים באופן אקראי כדי לשלוט על הטרוגניות.
7. אוטמים כל סט של 24 צינורות עם קרום חדיר. דגירה במשך 48 שעות.
8. מעבירים 200 μL מכל תרבית לצלחת של 96 בארות. מדוד OD_600nm באמצעות ספקטרופוטומטר.
   הערה: ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית ברוחב משתנה כדי להקל על המעבר בין צינורות מיקרוצנטריפוגות וצלחות 96 בארות.
9. שרטט ונתח נתונים באמצעות תוכנות סטטיסטיות (למשל, R).

7. ריצוף גנום שלם של שושלות מפותחות וזיהוי מוטציות

1. החיו שושלות צאצאים שאוחסנו בשלב 5.9 ב-BBM⁺ שחומם מראש ב-75°C של 48-72 שעות על ידי חיסון פיסת קרח מכל אוכלוסייה קפואה ל-BBM⁺ כמו בסעיף 2, שלבים 2.2-2.5. הכינו בין 1-10 מ"ל של נפח תרבית כדי לקבל כמות מספקת של DNA גנומי. עוצמת הקול המדויקת הנדרשת תלויה באפשרות שנבחרה לרצף בשלבים 7.2 או 7.3 (להלן).
   הערה: מומלץ גם לרצף את הזן המשמש להתחלת אוכלוסיות האבות. זאת כדי לקבוע נכונה אם מוטציות כלשהן שהתגלו בשושלות הצאצאים נוצרו במהלך ניסוי האבולוציה ולא לפני כן.
2. (אפשרות 1) לחלץ DNA גנומי ולהכין ספריות ריצוף Illumina עבור ריצוף Illumina.
   1. חילוץ וטיהור DNA גנומי באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית עבור חיידקים.
   2. ודא שהדנ"א הגנומי המופק עומד בדרישות הכמות והאיכות של ספק הריצוף באמצעות ערכות מסחריות המומלצות על ידי הספק.
   3. ביצוע הכנת ספריית DNA גנומית באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. מומלץ פרוטוקול קצה זוגי של 250 bp. אחסן DNA גנומי שחולץ ב -20 ° C עד מוכן לשלוח דגימות לספק ריצוף.
3. (אפשרות 2) לחלופין, שלח את הדגימות לספק מסחרי המבצע מיצוי DNA, בדיקות איכות DNA גנומיות, הכנת ספריית Illumina וריצוף Illumina כשירות משולב.
4. לנתח רצף גנומים כדי לזהות מוטציות.
   1. קבל קבצי FASTQ, ואם עדיין לא בוצע על ידי ספק הרצף, בצע חיתוך מתאם באמצעות Trimmomatic עם חיתוך איכות חלון הזזה של Q15.
   2. באמצעות קבצי FASTQ החתוכים, הפעל את צינור breseq (גרסה 0.38.1) כדי לזהות מוטציות, תוך השוואת קריאות הדנ"א הגנומי לרצף הייחוס של הזן שנבחר. עבור S. acidocaldarius DSM639, זהו RefSeq ID NC_007181.

8. (אופציונלי) הערכת צריכת האנרגיה של תרמומיקסר לעומת צריכת אנרגיה באינקובטור

1. כדי להשוות את צריכת האנרגיה של שימוש באינקובטור לעומת תרמומיקסר לצמיחה, מדוד את צריכת האנרגיה של כל מכשיר במשך 24 שעות באמצעות תקע ניטור אנרגיה.
2. השתמש בשני תקעים כדי למדוד את צריכת האנרגיה של שני המכשירים בו-זמנית. לחלופין, מדדו את צריכת האנרגיה בימים עוקבים.
3. נתק את האינקובטור או התרמומיקסר משקע החשמל. חבר את תקע ניטור האנרגיה לשקע ואתחל אותו בהתאם להוראות היצרן, כולל התקנת תוכנת הניטור והבקרה.
4. חבר את האינקובטור או התרמומיקסר לתקע ניטור האנרגיה ואפשר לו לפעול לפחות שעתיים (אך באופן אידיאלי למשך 24 שעות או יותר) כדי להשיג הערכה טובה של צריכת אנרגיה טיפוסית. רשום את צריכת האנרגיה של כל מכשיר.

תוצאות

מדידות עקומת גדילה
עקומות גדילה עבור S. acidocaldarius DSM639 מוצגות באיור 3A. הגידול נמצא דומה כאשר משווים דגירה באמצעות תרמומיקסרים לזו של אינקובטורים קונבנציונליים. פרמטרים של קצב צמיחה ממוצע הוערכו על ידי התאמת עקומה לוגיסטית לכל עקומת צמיחה מש?...

Discussion

עבודה זו פיתחה פרוטוקול אבולוציה ניסיוני עבור תרמופילים, המותאם כאן לארכאון S. acidocaldarius, אך ניתן להתאמה למיקרובים אחרים עם דרישות גידול בטמפרטורה גבוהה. פרוטוקול זה מתבסס על טכניקות שתוכננו בתחילה עבור חיידקים מזופיליים, אך שונה במיוחד כדי להתגבר על האתגרים הטכניים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.