Adattamento agli estremi della vita: evoluzione sperimentale con l'estremofilo Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di evoluzione sperimentale per l'adattamento nei termofili che utilizzano termomiscelatori da banco a basso costo ed efficienti dal punto di vista energetico come incubatori. La tecnica è dimostrata attraverso la caratterizzazione dell'adattamento alla temperatura in Sulfolobus acidocaldarius, un archeone con una temperatura di crescita ottimale di 75 °C.

Abstract

L'archaeon Sulfolobus acidocaldarius è emerso come un promettente sistema modello termofilo. Studiare come i termofili si adattano alle variazioni di temperatura è un requisito chiave, non solo per comprendere i processi evolutivi fondamentali, ma anche per sviluppare S. acidocaldarius come telaio per la bioingegneria. Uno dei principali ostacoli alla conduzione dell'evoluzione sperimentale con i termofili è il costo della manutenzione delle apparecchiature e del consumo energetico degli incubatori tradizionali per la crescita ad alta temperatura. Per affrontare questa sfida, viene presentato un protocollo sperimentale completo per condurre l'evoluzione sperimentale in S. acidocaldarius , utilizzando termomiscelatori da banco a basso costo ed efficienti dal punto di vista energetico. Il protocollo prevede una tecnica di coltura batch con volumi relativamente piccoli (1,5 mL), che consente il monitoraggio dell'adattamento in più linee indipendenti. Questo metodo è facilmente scalabile attraverso l'uso di termomiscelatori aggiuntivi. Tale approccio aumenta l'accessibilità di S. acidocaldarius come sistema modello, riducendo sia l'investimento iniziale che i costi correnti associati alle indagini sperimentali. Inoltre, la tecnica è trasferibile ad altri sistemi microbici per esplorare l'adattamento a diverse condizioni ambientali.

Introduzione

La vita primordiale sulla Terra potrebbe aver avuto origine in ambienti estremi, come le bocche idrotermali, che sono caratterizzate da temperature e acidità estremamente^elevate. I microbi continuano ad abitare ambienti estremi, tra cui le sorgenti termali e la solfatara vulcanica. Caratterizzare le dinamiche evolutive che si verificano in queste condizioni estreme può far luce sui processi fisiologici specializzati che consentono la sopravvivenza in queste condizioni. Ciò potrebbe avere implicazioni di vasta portata, dalla nostra comprensione delle origini della diversità biologica allo sviluppo di nuovi enzim....

Protocollo

1. Preparazione del terreno di crescita di S. acidocaldarius (BBM⁺)

NOTA: Per coltivare S. acidocaldarius, questo protocollo utilizza Basal Brock Medium (BBM⁺)²³. Questo viene preparato combinando prima le soluzioni stock inorganiche descritte di seguito per creare BBM⁻, che può essere preparato in anticipo. BBM⁺ viene quindi preparato secondo necessità aggiungendo le soluzioni stock organiche a BBM⁻. Le ricette della soluzione madre sono presentate anche nella Tabella 1. Tutti i....

Discussione

Questo lavoro ha sviluppato un protocollo di evoluzione sperimentale per i termofili, qui adattato per l'archaeon S. acidocaldarius, ma adattabile ad altri microbi con esigenze di crescita ad alta temperatura. Questo protocollo si basa su tecniche inizialmente progettate per i batteri mesofili, ma è specificamente modificato per superare le sfide tecniche associate alla crescita aerobica ad alta temperatura 2,4,5,24.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.