Anpassung an den Extremen des Lebens: Experimentelle Evolution mit dem extremophilen Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein experimentelles Evolutionsprotokoll zur Anpassung bei Thermophilen vor, bei dem kostengünstige, energieeffiziente Tisch-Thermomischer als Inkubatoren verwendet werden. Die Technik wird durch die Charakterisierung der Temperaturanpassung bei Sulfolobus acidocaldarius, einem Archaeon mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 75 °C, demonstriert.

Zusammenfassung

Das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius hat sich als vielversprechendes thermophiles Modellsystem herauskristallisiert. Die Untersuchung, wie sich Thermophile an wechselnde Temperaturen anpassen, ist eine wichtige Voraussetzung, nicht nur für das Verständnis grundlegender evolutionärer Prozesse, sondern auch für die Entwicklung von S. acidocaldarius als Chassis für das Bioengineering. Ein großes Hindernis für die Durchführung experimenteller Evolutionsprozesse mit Thermophilen sind die Kosten für die Wartung der Ausrüstung und den Energieverbrauch traditioneller Inkubatoren für das Hochtemperaturwachstum. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird ein umfassendes Versuchsprotokoll für die Durchführung der experimentellen Evolution in S. acidocaldarius vorgestellt, bei dem kostengünstige und energieeffiziente Tisch-Thermomischer zum Einsatz kommen. Das Protokoll beinhaltet eine Batch-Kulturtechnik mit relativ kleinen Volumina (1,5 ml), die die Verfolgung der Adaptation in mehreren unabhängigen Linien ermöglicht. Diese Methode ist durch den Einsatz von zusätzlichen Thermomischern leicht skalierbar. Ein solcher Ansatz erhöht die Zugänglichkeit von S. acidocaldarius als Modellsystem, indem er sowohl die Anfangsinvestitionen als auch die laufenden Kosten für experimentelle Untersuchungen reduziert. Darüber hinaus ist die Technik auf andere mikrobielle Systeme übertragbar, um die Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen zu erforschen.

Einleitung

Frühes Leben auf der Erde könnte in extremen Umgebungen entstanden sein, wie z. B. in hydrothermalen Quellen, die durch extrem hohe Temperaturen und Säuregehalt gekennzeichnet sind¹. Mikroben bewohnen nach wie vor extreme Umgebungen, darunter heiße Quellen und vulkanische Solfatara. Die Charakterisierung der evolutionären Dynamik, die unter diesen extremen Bedingungen abläuft, könnte Aufschluss über die spezialisierten physiologischen Prozesse geben, die das Überleben unter diesen Bedingungen ermöglichen. Dies kann weitreichende Auswirkungen haben, vom Verständnis der Ursprünge der biologischen Vielfalt bis hin....

Protokoll

1. Zubereitung von S. acidocaldarius Wachstumsmedium (BBM⁺)

HINWEIS: Für die Kultivierung von S. acidocaldarius wird in diesem Protokoll das Basal Brock Medium (BBM⁺)²³ verwendet. Dies wird hergestellt, indem zunächst die unten beschriebenen anorganischen Stammlösungen zu BBM⁻ kombiniert werden, das im Voraus hergestellt werden kann. Anschließend wird BBM⁺ nach Bedarf durch Zugabe der Bio-Stammlösungen zu BBM⁻ aufbereitet. Rezepturen für Stammlösungen sind ebenfalls in Tabelle 1 ....

Diskussion

In dieser Arbeit wurde ein experimentelles Evolutionsprotokoll für Thermophile entwickelt, das hier auf das Archaeon S. acidocaldarius zugeschnitten ist, aber an andere Mikroben mit hohen Anforderungen an das Wachstum angepasst werden kann. Dieses Protokoll baut auf Techniken auf, die ursprünglich für mesophile Bakterien entwickelt wurden, wurde jedoch speziell modifiziert, um die technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit dem aeroben Wachstum bei hohen Temperaturen zu.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.