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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos el protocolo paso a paso para investigar los efectos terapéuticos e inhibidores vasculares de la fórmula de Sanleng Jiashen en ratones BALB/c-nu con carcinoma hepatocelular ortotópico.

Resumen

La letalidad del cáncer de hígado y la resistencia a los fármacos químicos han obligado a buscar recetas efectivas de hierbas tradicionales para el cáncer de hígado. Los modelos animales que son repetibles, fáciles de manipular e imitan en gran medida los procesos fisiopatológicos del cáncer de hígado son el requisito previo para el cribado exitoso de candidatos a fármacos eficaces. Mientras tanto, los indicadores y medios confiables de evaluación de la eficacia de los medicamentos también son la garantía de la investigación y el desarrollo de medicamentos contra el cáncer de hígado.

Fórmula de Sanleng Jiashen, una receta representativa de la medicina tradicional china que contiene Sparganium stoloni erum, Buch. -Jamón. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (ruibarbo), y Ligusticum chuanxiong Hort (Chuanxiong), se prescribe para nutrir el hígado y eliminar el calor, eliminar toxinas y promover la circulación sanguínea para tratar el cáncer de hígado. Este protocolo experimental describe la preparación de la fórmula liofilizada de Sanleng Jiashen y el proceso de establecimiento del cáncer de hígado in situ en ratones BALB/c-nu. Se utilizaron tinción histopatológica, detección inmunohistoquímica de marcadores de cáncer, imágenes in vivo de ratones y prueba de membrana corioalantoidea de embriones de pollo para explorar el efecto inhibidor y antiangiogénico de la fórmula de Sanleng Jiashen en la proliferación maligna del tejido de cáncer de hígado. Los datos muestran que la fórmula de Sanleng Jiashen puede resistir eficazmente la proliferación maligna del tejido de cáncer de hígado, que se manifiesta por una reducción del volumen de la masa tumoral, un mejor daño patológico y niveles más bajos del marcador de cáncer ki67.

La inhibición superior de la angiogénesis también sugiere que la fórmula de Sanleng Jiashen puede tener el potencial de tratar y prevenir la progresión y el deterioro del cáncer de hígado. Todo el esquema experimental muestra un proceso integral de los componentes de la medicina tradicional china en el tratamiento del cáncer de hígado de ratón, que proporciona una referencia para el establecimiento y la optimización de un modelo de cáncer de hígado, así como para la investigación y el desarrollo de medicamentos para prevenir y tratar el cáncer de hígado.

Introducción

El cáncer de hígado es un cáncer mortal que se origina en el hígado y es la segunda causa más común de muerte relacionada con elcáncer en todo el mundo. Las tasas de enfermedad hepática en los Estados Unidos y algunos países en desarrollo muestran niveles altos, y podría haber más de 1 millón de casos de cáncer de hígado en todo el mundo para 20302. Debido a los hábitos de vida poco saludables, como el tabaquismo, la obesidad y el consumo de alcohol, y los estragos de la hepatitis B, la hepatitis C y otros virus, la incidencia y la mortalidad del cáncer de hígado han aumentado significativamente añotras año. Al ser un tumor maligno heterogéneo con diferentes características histológicas y mal pronóstico, el cáncer de hígado tiene un rango muy amplio de incidencia, incluyendo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma intrahepático y cáncer de hígado fibrolamelar4. El cáncer de hígado a menudo se diagnostica en una etapa avanzada, y muchos pacientes avanzados no son candidatos para la radioterapia5. El inhibidor de la multicinasa sorafenib es un fármaco muy aceptado para los pacientes con cáncer de hígado avanzado, pero los pacientes suelen desarrollar una resistencia significativa en un corto periodo de tiempo6. En la actualidad, los inhibidores de puntos de control inmunitario PD-1 y PD-L1 combinados con sorafenib han logrado algunos avances en el control del desarrollo del cáncer de hígado, pero el efecto terapéutico sigue siendo controvertido7.

El cáncer de hígado ortotópico es un tipo temprano de cáncer de hígado: las células cancerosas no se han diseminado alrededor del tejido hepático ni producen metástasis interorgánicas, y la función del hígado no se ve muy afectada8. Debido a que el cáncer de hígado ortotópico generalmente no presenta síntomas de malestar obvios, algunos pacientes pueden tener dolor hepático leve, fatiga yotros síntomas. En la práctica clínica, la ecografía Doppler color del hígado y el examen de tomografía computarizada mejorada pueden diagnosticar lesiones importantes que ocupan espacio en el hígado10. A pesar de que el cáncer de hígado local que no se ha diseminado y metastatizado puede ser extirpado mediante cirugía, existen ciertos riesgos quirúrgicos y la inevitable carga psicológica para los pacientes11. La quimiorradioterapia puede destruir la totalidad o parte de las células cancerosas del hígado, y la inmunosupresión a largo plazo en pacientes con medicación puede afectar la eficacia del tratamiento y aumentar el riesgo de otras enfermedades12. Por lo tanto, la búsqueda de una terapia farmacológica segura y eficaz para la prevención y el tratamiento tempranos del cáncer de hígado es la clave para frenar la progresión y el deterioro del cáncer de hígado.

El principio de la medicina china para tratar el cáncer de hígado se basa en el concepto de equilibrio y armonía dentro del cuerpo. La medicina china considera el cáncer de hígado como un desequilibrio o falta de armonía en la energía del cuerpo, conocida como Qi, que afectaal hígado. El tratamiento de la medicina china para el cáncer de hígado implica varios enfoques, que incluyen medicina herbal, acupuntura, terapia dietética y recomendaciones de estilo de vida. El principio es restaurar el equilibrio del Qi, fortalecer los mecanismos de defensa del cuerpo y promover la capacidad del cuerpo para curarse a sí mismo14,15. El cáncer de hígado en la medicina tradicional china pertenece a la categoría de "timpanitas" y "acumulación de hígado". Ya que el "Canon Interior de Huangdi" tiene un registro detallado de sus síntomas, el cáncer de hígado es causado por la estasis de la sangre y la deficiencia de Zhengqi y se trata mediante la eliminación de la estasis de la sangre, la eliminación de los timpanitas y el fortalecimiento de la resistencia del cuerpo para consolidar la constitución13. La píldora Sanleng se originó en el libro "Weisheng Baojian" escrito por Luo Tianyi, un famoso médico de la dinastía Yuan. Está compuesto por tres tipos de fármacos: Sparganium stoloni erum, Buch. -Jamón. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) y Rheum officinale Baill. (ruibarbo). Estos tres tipos de fármacos pueden entrar en el meridiano hepático y tienen valor terapéutico para el tratamiento del cáncer de hígado14. La fórmula de Sanleng Jiashen está compuesta por 16 g de Sanleng, 16 g de Panax ginseng C.A.Mey. (ginseng), 8 g de ruibarbo y 2 g de Chuanxiong (Figura 1), que se prescribe para tonificar el hígado, eliminar el calor, eliminar toxinas y promover la circulación sanguínea. Se cree que estas hierbas tienen propiedades anticancerígenas y ayudan a reducir el crecimiento tumoral, aliviar los síntomas y mejorar el bienestar general. En los experimentos in vitro anteriores, la fórmula de Sanleng Jiashen puede inhibir la proliferación de células de cáncer de hígado15. Sin embargo, ¿cómo evaluar el efecto inhibidor de los compuestos herbales chinos en el cáncer de hígado de manera eficiente y razonable? Mediante el establecimiento de un modelo de cáncer de hígado in situ de ratón BALB/c-nu, se investigó el efecto inhibidor de la fórmula de Sanleng Jiashen sobre el cáncer de hígado y la angiogénesis principalmente a través de imágenes de animales pequeños y pruebas de membrana corioalantoidea de embriones de pollo.

Protocolo

Se alimentaron ratones desnudos machos BALB/c-nu libres de patógenos específicos, de 5 semanas de edad y con un peso de 18-22 g en el Centro Experimental Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Jilin; las condiciones de alimentación fueron de 22 °C-24 °C con 40%-60% de humedad relativa. El número de licencia de animales de experimentación es SYXK (Ji) 2018-0006, y el proceso experimental cumple con las reglas y regulaciones del Comité de Ética de la Universidad de Jilin, y el número de aprobación de ética animal es 20221228-01.

1. Preparación de la fórmula 15 de Sanleng Jiashen liofilizada.

  1. Coloque 16 g de Sanleng, 16 g de ginseng, 8 g de ruibarbo y 2 g de Chuanxiong en una olla de decocción inteligente (consulte la Tabla de materiales) y remoje en 294 ml de agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de calentar y hervir, continúe cocinando durante 30 minutos a 100 °C y filtre el líquido a través de una gasa médica doble (consulte la tabla de materiales). Añadir 252 mL de agua desionizada al residuo, cocinar durante 30 min a 100 °C y filtrar el líquido con doble gasa.
  2. Recoja el filtrado del paso 1.1 en un plato limpio de acero inoxidable y congele durante 12 h a -80 °C (consulte la tabla de materiales).
  3. Coloque la fórmula de Sanleng Jiashen del paso 1.2 en un liofilizador al vacío (ver Tabla de Materiales) (temperatura de la trampa fría: -55 °C) y seque durante 48 h para obtener el polvo liofilizado de la fórmula de Sanleng Jiashen.

2. Construcción de una línea celular HCCLM3 que expresa luciferasa de manera estable16

  1. Añadir 1,0 mL de suspensión celular HCCLM3 en la placa de 24 pocillos (ver Tabla de Materiales) con 5 × 105 células/pocillo y cultivo en un medio completo (10% de suero fetal bovino + 1% de solución de penicilina-estreptomicina + DMEM) (ver Tabla de Materiales) que contenga 3 μg/mL de puromicina durante 72 h en una incubadora celular (37 °C, 5% CO2, ver Tabla de Materiales).
  2. Deseche el sobrenadante celular en el paso 2.1 y agregue 100 μL de solución de tripsina al 0,25% para digerir las células en una incubadora celular durante 1 minuto (consulte la Tabla de materiales). Añadir 300 μL de medio completo y utilizar una pipeta para liberar las células adherentes y finalizar la digestión. Recoja todas las suspensiones celulares y colóquelas en un tubo de centrífuga de 15 ml a temperatura ambiente a 1.000 × g durante 5 minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 1 mL de medio completo y mezcle por pipeteo.
  3. Añada 100 μL de suspensión celular de 4 × 103 células HCCLM3/pocillo del paso 2.2 en una placa de 96 pocillos y cultive en una incubadora celular durante 24 h (37 °C, 5% de CO2, ver Tabla de Materiales).
  4. Añadir 0,27 μL de lentivirus GFP a las placas de 96 pocillos en el paso 2.3 y cultivar en una incubadora celular durante 15 h (37 °C, 5% de CO2, ver Tabla de Materiales). Deseche el sobrenadante celular, agregue 100 μL de medio de cultivo completo y adquiera imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 507 nm (consulte la tabla de materiales).
  5. Reemplace 2 mL de lentivirus GFP y continúe con el cultivo durante 24 h. Reemplace 2 mL de medio de cultivo completo sin lentivirus GFP durante otras 24 h.
    NOTA: La eficiencia de transfección del lentivirus GFP en células HCCLM3 fue del 80% como se observó bajo un microscopio de fluorescencia invertida.
  6. Añadir 5 mL de suspensión de 2 × 105 células del paso 2.1 en una placa de Petri de 60 mm y cultivar en una incubadora de células durante 24 h. Añadir 64,5 μL de luciferasa y continuar con el cultivo en una incubadora de células durante 15 h (37 °C, 5% de CO2, ver Tabla de Materiales).
  7. Deseche el sobrenadante y agregue 5 mL de medio completo para continuar con el cultivo hasta que las células hayan alcanzado un 90% de confluente en la placa de Petri. Deseche el sobrenadante celular, lávese con 2 x 1 mL de PBS y agregue 1 mL de solución de tripsina al 0,25% para digerir las células en una incubadora celular durante 1 min (37 °C, 5% CO2, ver Tabla de Materiales). Añadir 3 mL de medio completo y pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta las células adherentes libres y finalizar la digestión. Recoja todas las suspensiones celulares para la posterior inyección en el ratón.
    NOTA: Para obtener un número suficiente de células, las células se hicieron pasar y cultivar continuamente.

3. Establecimiento de un modelo de ratón desnudo BALB/c-nu de cáncer de hígado in situ y tratamiento15

  1. Añadir 100 μL de 1 × 107 células HCCLM3 transfectadas con luciferasa en el paso 2.7 y 100 μL de pegamento de matriz (ver Tabla de Materiales) en un tubo de centrífuga de 1,5 mL (ver Tabla de Materiales), y mezclar ligeramente con una pipeta de 1 mL (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Todo el proceso de preparación de la solución debe llevarse a cabo con hielo para evitar que el pegamento de la matriz se cure.
  2. Desinfectar las axilas izquierda y derecha de los ratones desnudos BALB/c-nu con yotopina (ver Tabla de Materiales) y desyodar con alcohol (ver Tabla de Materiales).
  3. Inyecte lentamente 100 μL de la mezcla de células HCCLM3 y pegamento de matriz del paso 3.1 en las axilas izquierda y derecha de ratones desnudos BALB/c-nu con una jeringa desechable de 1 mL.
    NOTA: Después de aproximadamente 10 días, los ratones desnudos BALB/c-nu desarrollaron una masa tumoral de aproximadamente 0,5cm3 en el sitio de inyección bilateral en la axila.
  4. Anestesiar ratones desnudos BALB/c-nu en el paso 3.3 mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1%, 50 mg/kg de pentobarbital. Cortar la piel de ambas axilas con una tijera oftálmica y una pinza (ver Tabla de Materiales), y pelar suavemente la masa tumoral subcutánea para colocarla en una placa de cultivo celular (ver Tabla de Materiales) que contenga tampón PBS preenfriado (ver Tabla de Materiales), y cortarla enpedazos de 1 mm y 3 pedazos con un bisturí (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: La masa tumoral axilar de ratones desnudos BALB/c-nu debe recolectarse en hielo dentro de las 0,5 horas para mantener la actividad de las células tumorales y aumentar la tasa de éxito del modelo. Al final del muestreo, los ratones fueron eliminados mediante la extirpación de las vértebras cervicales. Si hay una parte necrótica del tumor, es necesario extirparla, dejando solo el tumor blanco de pescado para prevenir la infección durante el trasplante ortotópico de cáncer.
  5. Anestesiar ratones desnudos BALB/c-nu con pentobarbital sódico al 1%, 50 mg/kg por vía intraperitoneal (ver Tabla de Materiales), desinfectar el abdomen con yodo (ver Tabla de Materiales) y desyodar con alcohol (ver Tabla de Materiales).
  6. Utilice una tijera oftálmica y una pinza (consulte la Tabla de materiales) para cortar una incisión quirúrgica de 45° aproximadamente 1 cm en la posición de 0,5 cm por debajo de la apófisis xifoides para exponer el hígado, presione suavemente el hígado para exprimir el tejido hepático y fije el hígado con papel de pesar.
    NOTA: Se pueden colocar hisopos o palos de algodón debajo de las costillas de los ratones para exponer eficazmente el hígado.
  7. Tome una pequeña muestra de tejido tumoral en el paso 3.4 con una aguja de inyección desechable de 10 ml e implante la masa tumoral en el hígado a unos 0,5 cm paralelos al hígado para fijarla debajo de la cápsula hepática y retirar lentamente la aguja.
    NOTA: Use una jeringa desechable de 1 mL para dejar caer 2 gotas del pegamento de matriz derretida, observe la masa tumoral sin deslizamientos accidentales ni sangrado, y luego sutura la incisión quirúrgica.
  8. Cierre la incisión quirúrgica con una aguja de 12 cm con pinzas de sujeción y suturas quirúrgicas 6-0 (ver Tabla de Materiales). Aplique el ungüento oftálmico de eritromicina (consulte la Tabla de materiales) en el sitio quirúrgico para prevenir la infección. Coloque a los ratones en una almohadilla térmica (consulte la Tabla de materiales) y manténgalos en jaulas separadas después de despertarlos.
  9. A partir del primer día después del modelado, administre 7,5 mg/kg de sorafenib y la fórmula de Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg y 31,2 g/kg) por sonda nasogástrica a los ratones del paso 3.8 durante 14 días, una vez al día. Administre un volumen igual de solución salina normal a los ratones del grupo modelo.

4. Evaluación por imagen in vivo

NOTA: El día 14, se realizaron imágenes en vivo 1 h después del final de la administración.

  1. Encienda la computadora y el instrumento de imagen in vivo (consulte la Tabla de materiales). Haga doble clic en el icono de imagen viva en el escritorio para iniciar el programa. Haga clic en inicializar el sistema IVIS en el panel de control para iniciar todo el sistema IVIS.
    NOTA: Después de que la máquina complete la autoevaluación, la luz de estado de temperatura en el panel de control es roja. Espere unos 5-10 minutos después de que baje la temperatura y la luz se vuelva verde, se puede realizar la adquisición de imágenes.
  2. Desinfectar el abdomen de los ratones con alcohol e inyectar por vía intraperitoneal 10 μL de D-luciferina por g de peso corporal (ver Tabla de Materiales) con una jeringa desechable. Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal al 1%, 50 mg/kg de pentobarbital sódico.
    NOTA: La D-luciferina se diluyó con PBS estéril a 15 mg/mL.
  3. Coloque los ratones anestesiados en el paso 4.3 en la caja de observación y cierre la puerta, configure el tiempo de exposición en 30 s en el panel de control: Selección de modo: seleccione la luminenscencia de acuerdo con el tipo de muestra, seleccione el programa automático de forma predeterminada y presione adquirir para adquirir imágenes.
  4. Haga clic en Guardar datos de imagen viva, seleccione Todos los archivos de datos de imagen viva y guárdelo en el escritorio de la computadora.
  5. Haga clic en Salir en la imagen viva en la pantalla principal. Apague la alimentación de la cámara, la alimentación del instrumento de imagen y la alimentación del ordenador a su vez.
  6. Después de las imágenes, eutanasia de los ratones anestesiados (inyección intraperitoneal del 1%, 50 mg/kg de pentobarbital sódico) por luxación de vértebras cervicales.

5. Tinción de hematoxilina-eosina17

  1. Fije el tejido hepático fresco de ratones del paso 4.7 en paraformaldehído al 4% durante 48 h, y luego enjuague con agua corriente 3 veces durante 5 minutos cada vez para lavar el paraformaldehído (ver Tabla de materiales).
  2. Deshidratar los tejidos hepáticos en el paso 5.1 en etanol al 30%, etanol al 50%, etanol al 70%, etanol al 95%, figure-protocol-12174etanol figure-protocol-12269al 95% y etanol anhidro durante 1 h por turnos (ver Tabla de Materiales).
  3. Coloque los tejidos hepáticos deshidratados en el paso 5.2 a 50% de etanol, 50% de xileno, xileno figure-protocol-12556, xileno figure-protocol-12653y xileno figure-protocol-12750 secuencialmente para hacerlos transparentes durante 1 h (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El xileno es volátil y tóxico, este paso se lleva a cabo en la campana extractora.
  4. Derrita la cera de parafina y mantenga la temperatura a unos 55 °C. Coloque los bloques de tejido hepático en el paso 5.3 en una máquina de inclusión de parafina (ver Tabla de Materiales) llena de solución de cera para la inclusión.
  5. Fije el bloque de cera incrustado de tejido hepático de ratón en el paso 5.4 en la máquina cortadora de parafina (consulte la tabla de materiales), córtelo en rodajas de 5 μm de grosor, coloque las rodajas completamente planas en agua a 50 ° C y recójalas con un portaobjetos. Por último, colóquelos en una máquina de hornear tejidos biológicos para que se sequen 20 min a 70 °C (ver Tabla de Materiales).
  6. Remoje las secciones de 5 μm en el paso 5.5 en xileno figure-protocol-13814, xileno figure-protocol-13911, etanol figure-protocol-14008anhidro y etanol figure-protocol-14113 anhidro durante 10 minutos sucesivamente, luego remoje en etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 80% y etanol al 70% durante 5 minutos respectivamente, y finalmente lave con agua destilada para el tratamiento de desparafinado (consulte la Tabla de materiales).
  7. Teñir las secciones de tejido hepático de cera de parrafina deshidratadas de 5 μm de espesor con hematoxilina durante 8 minutos y luego enjuagar con agua corriente.
  8. Diferenciar en solución de ácido clorhídrico al 1% durante 10 s y enjuagar con agua corriente durante 30 min (ver Tabla de Materiales).
  9. Colorear con solución de eosina al 0,5% durante 1 min (ver Tabla de Materiales).
  10. Coloque las rodajas en alcohol figure-protocol-14968al 95%, alcohol figure-protocol-15072al 95%, etanol figure-protocol-15175anhidro, etanol figure-protocol-15279anhidro, xileno figure-protocol-15383y xileno figure-protocol-15480 durante 5 minutos cada una para que se deshidraten (consulte la Tabla de materiales).
  11. Selle con goma neutra y tome fotos bajo un microscopio de luz invertida (consulte la Tabla de materiales).

6. Tinción inmunohistoquímica18

  1. Deje caer 1,5% de H2O2 en las secciones de 5 μm de hígado de ratón en el paso 5.6 e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego lave con PBS durante 2 x 5 minutos (consulte la Tabla de materiales).
  2. Repare el tejido con una solución de ácido cítrico (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos y lávese con PBS durante 3 x 5 minutos.
  3. Incubar con tritón X-100 al 0,2% (ver Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 4 min, luego incubar con tritón X-100 al 0,5% a temperatura ambiente durante 4 min, y lavar con PBS.
  4. Añadir suero de cabra (ver Tabla de Materiales) para sellar durante 15 min, luego añadir el anticuerpo primario ki67 (ver Tabla de Materiales) diluido con PBS (1:300) para incubar a 4 °C durante la noche. Lavar con PBS durante 3 x 5 min.
  5. Incubar con anticuerpo secundario diluido con PBS (1:200) a temperatura ambiente durante 1 h y lavar con PBS durante 3 x 5 min (ver Tabla de Materiales).
  6. Teñir con la solución reveladora durante 5 min y enjuagar con agua bidestilada (ver Tabla de Materiales).
  7. Vuelva a teñir con hematoxilina durante 2 min, diferencie en una solución de ácido clorhídrico al 1% durante 10 s y enjuague con agua corriente durante 30 min (ver Tabla de Materiales).
  8. Coloque las rodajas en alcohol figure-protocol-17413al 95%, alcohol figure-protocol-17517al 95%, etanol figure-protocol-17620anhidro, etanol figure-protocol-17724anhidro, xileno figure-protocol-17828y xileno figure-protocol-17925 durante 5 minutos cada una para que se deshidraten (consulte la Tabla de materiales).
  9. Selle con goma neutra y tome fotos bajo un microscopio de luz invertida (ver Tabla de Materiales).

7. Prueba de membrana corioalantoidea de embrión de pollo19

  1. Deje los huevos de gallina de plumas blancas (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 2 h y rocíe con alcohol para desinfectar. Perfore un agujero en la cámara de aire con un taladro de cráneo (consulte la tabla de materiales) e incube los huevos con la cámara de aire hacia arriba durante 7 días (temperatura de incubación 37,8-38,2 °C y humedad relativa 65%).
    NOTA: Durante los primeros 3 días de incubación, se enciende el botón de giro automático del huevo para evitar que la membrana corioalantoidea del embrión de pollito se adhiera a la cáscara y cree una falsa cámara de aire.
  2. Deseche los huevos débiles/no fertilizados en el iluminador de huevos (consulte la Tabla de materiales). Despegue una ventana de 1 x 1 cm con cuidado con pinzas para ojos (ver Tabla de Materiales) después de perforar un agujero en la cámara de aire falsa con un taladro de cráneo (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Tenga en cuenta que la cáscara del huevo no debe caer en la membrana corioalantoidea del embrión de pollo.
  3. En el día 8 de incubación, agregue 100 μL de suspensión de células tumorales (1 × 106 células) a cada óvulo de la cámara de aire falso, excepto para el grupo de control. En los grupos de fármacos, añadir 100 μL de solución de sorafenib y fórmula de Sanleng Jiashen. En los grupos de control y modelo, agregue 100 μL de PBS.
    NOTA: La suspensión de células tumorales está compuesta por células HCCLM3 y pegamento de matriz en igual volumen. La concentración del fármaco se establece de la siguiente manera: 7,5 mg/kg de sorafenib y fórmula de Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg y 31,2 g/kg).
  4. Cubra la ventana con un apósito transparente (ver Tabla de Materiales) y desinfecte con alcohol en aerosol (ver Tabla de Materiales). Después de 7 días de incubación, retire el apósito transparente y agregue 1 mL de fijador (metanol: acetona = 1:1) (ver Tabla de Materiales) de la cámara de aire falso para una fijación de 30 min.
  5. Deseche el fijador con una jeringa de 1 mL. Corte la membrana corioalantoidea de ~ 5 x 5 cm en la cámara de aire falsa con tijeras oftálmicas y colóquela en una placa de Petri de 60 mm.
    NOTA: Para la membrana corioalantoidea del embrión de pollo con sangre, enjuague con PBS. Para embrión de pollo, membrana corioalantoidea adherida al tejido, separar con tijeras oftálmicas.
  6. Coloque la membrana corioalantoidea del paso 7.5 bajo un microscopio óptico y fotografíe los vasos (ver Tabla de Materiales).

Resultados

Como se muestra en la Figura 2A, establecimos un modelo de cáncer de hígado in situ de ratones BALB/c-nu y evaluamos el efecto antitumoral de la fórmula de Sanleng Jiashen. La Figura 2B presenta que la fórmula de Sanleng Jiashen puede suprimir significativamente el crecimiento de tumores hepáticos. Los resultados patológicos indicaron que, en comparación con el grupo de control, los focos tumorales del grupo mode...

Discusión

Una gran cantidad de evidencia ha confirmado que Sanleng, ginseng, ruibarbo y Chuanxiong en la fórmula de Sanleng Jiashen tienen efectos farmacológicos en el tratamiento del cáncer de hígado. Los estudios han demostrado que Sanleng puede inhibir significativamente la proliferación y el crecimiento de las células tumorales para prevenir la invasión y metástasis de las células tumorales, inducir la apoptosis celular y regular el ciclo celular y el microambientetu...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Filosofía y Ciencias Sociales de China (20VYJ070), el Proyecto del Departamento de Educación Provincial de Jilin (JJKH20230963KJ) y el Proyecto de Ingeniería del Segundo Lote de Xinglin Scholars en la Universidad de Medicina China de Changchun (QNKXJ2-2021+ZR25).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin solutionHyClone, AmericaSH30042.01B
1 mL disposable syringeMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinaRWSB
1% Penicillin & streptomycin solutionHyclone, AmericaSV30010
1.5 mL centrifuge tubeCorning, AmericaMCT-150-C-S
12 cm needle forcepsHesdick, ChinaHKQS-211
6-0 surgical suturesShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaCR631
75% alcoholSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China1.00009E+11
96-well platesNEST, China701001
AcetoneTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinaGB686-89
BALB/c-nu male nude miceBeijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machineLeica, GermanyLeica HI1220
Cell culture dishNEST, ChinaNEST.706001
Citric acid solutionWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinasj1074
D-luciferinGold Biotechnology®, Inc., ChinaLUCK-100
DMEMHyclone, AmericaSH30243.01
Egg illuminatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinaWZSDT
Eosin staining solutionHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China110703061
Erythromycin eye ointment Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, ChinaH37022025
Fetal bovine serumClark, AmericaFB25015 
Fully automatic intelligent chick incubatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China29538
GFP lentivirus solutionSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaF22AZ
Goat serumShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinaWLA067
Hand-held mouse skull drillSTRONGWT, China190
HCCLM3 cell lineWheLab, Shanghai, ChinaC1010
Heating padZhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinaGEJRD-10W
HematoxylinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinaB-YH250-1
Intelligent decoction potHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China3003BQ
 Inverted fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73
ki67 primary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB121141-100
Lodophor disinfectantCofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China202110073
LuciferaseSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaE26JZ
Matrix glueCorning, America356234
Medical gauzeYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China71712049971
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China1.17001.023
Ophthalmic scissorHesdick, ChinaHKQS-209
Ophthalmic tweezerHesdick, ChinaHKCL-20
Paraffin embedding machineLeica, Germany EG1150H
Paraffin slicing machineLeica, GermanyLeica CM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinaBL539A
PBS bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaG2156-1L
PuromycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP8230
RefrigeratorThermo Scientific, AmericaTDE40086FV-ULTS
ScalpelHesdick, ChinaHKCL-93
Secondary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB23301
Small animal live imaging systemCaliper Life Sciences, AmericaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China284461-73-0 
Transparent dressing3M, America9534HP
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT8200
Vacuum freeze dryer Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinasz-10N
White feather chicken eggsShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinaSCXK(Lu) 20180004
XyleneSigma-Aldrich, , America534056

Referencias

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